间充质干细胞外泌体——新的心血管疾病治疗策略

公绪合 综述 李虹伟 审校

(首都医科大学附属北京友谊医院心脏中心代谢紊乱相关心血管疾病北京市重点实验室，北京100050)

心血管疾病在世界范围内发病率高、死亡率高，随着经皮冠脉介入术和冠状动脉旁路移植术的发展，心肌梗死患者的生存有了大幅度改善。然而，这些幸存者中大部分由于心肌细胞凋亡和心肌重构最终死于心力衰竭。心肌组织难以增殖和分化，目前心脏移植是终末期心力衰竭的最终治疗选择，但移植供体来源、伦理学限制等，使得心脏移植数目有限。因此，需要研究用于心肌梗死和心力衰竭新的治疗方法，以改善这些患者的预后。

目前，许多学者研究了干细胞治疗心肌梗死和缺血性心力衰竭的疗效，尤其是间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)在临床研究中显示了良好的安全性和有效性。最早的基础研究表明，MSCs有分化为多种类型细胞，包括心肌细胞、血管内皮细胞和血管平滑肌细胞的潜力。然而，随后的研究并没有证实MSCs显著的分化能力，大多数静脉注射的干细胞在肺内潴留，而不是心脏；而且即使通过冠状动脉移植干细胞，移植14 d后仅仅有6%的细胞潴留在梗死区域。进一步研究显示MSCs培养液上清能够改善心脏功能，这说明干细胞移植改善心脏功能，不是通过心肌细胞分化，而是旁分泌作用。许多干细胞旁分泌因子直接修复再生心肌组织，为未来无细胞治疗提供了一种选择，外泌体(exosome)作为干细胞旁分泌的集合体，在旁分泌治疗心血管疾病中被广泛研究。现综述外泌体在心血管疾病治疗中的作用和研究进展。

1 外泌体概述

外泌体是从细胞中释放的直径30～100 nm的小囊泡，是个复杂的集合体，包括多种细胞因子、蛋白质、脂质、mRNAs、miRNAs和核糖体RNAs等[1]。最早由Johnstone等研究者在研究网织红细胞向成熟红细胞的转变过程中发现，后来研究发现各种细胞包括T细胞、B细胞、网织红细胞、肥大细胞和肿瘤细胞均可产生外泌体。比如从慢性粒细胞白血病细胞分泌的miR-126可以进入内皮细胞，调控细胞黏附和迁移。

外泌体被认为是细胞间的中枢介质，将蛋白质、mRNAs和miRNAs等转移到邻近细胞，从而在生物体中发挥调控作用。同样，MSCs可以合成和分泌富含高磷脂的功能性外泌体，比如脂肪MSCs分泌的外泌体可以调节MSCs的血管生成潜能[2]。此外，注射骨髓MSCs外泌体至脑梗死大鼠能够促进梗死病灶区血管和神经生长。在心血管研究领域，干细胞外泌体的治疗作用更是得到了高度认可，下面将从不同的角度阐述干细胞外泌体与心血管疾病研究。

2 外泌体对心血管系统作用

2.1 抗凋亡作用

心肌梗死由于冠状动脉血管狭窄、堵塞，心肌供血不足，发生进行性心肌细胞凋亡和丢失，最终引起心力衰竭，由于心肌细胞难以再生，使得修复梗死心肌成为治疗难点。MSCs的出现为修复心肌细胞提供了治疗方法，其作用不是直接分化为心肌细胞，而是旁分泌作用能够抗心肌细胞凋亡[3-4]。

最近的研究报道，骨髓MSCs延缓缺血性心肌细胞损伤，外泌体靶向转移miR-22结合甲基CpG结合蛋白2以抑制心肌细胞凋亡。外泌体miR-221通过抑制p53表达，上调凋亡蛋白Bcl-2，介导骨髓MSCs的抗凋亡作用。p53介导凋亡与Bcl-xL和p53相互作用，激活促凋亡蛋白而抑制抗凋亡蛋白，而MSCs外泌体通过miR-221抑制p53介导的凋亡，能够促进心肌细胞生存[5]。既往细胞实验使用MSCs条件培养基处理缺氧无血清的h9c2心肌细胞，结果同样显示MSCs条件培养基能够抗缺氧诱导h9c2心肌细胞凋亡，而外泌体就存在于条件培养基中。综上研究表明，外泌体参与了抗心肌细胞凋亡的过程。

2.2 抗炎症作用

众所周知，树突状细胞和肿瘤细胞的外泌体均参与抑制炎症反应的过程，被认为是治疗某些疾病的新方法[6]。同样，一些研究也证明来源于骨髓的MSCs外泌体在心血管疾病治疗中有类似作用，比如MSCs外泌体抑制炎症来减轻肺动脉高压[7]。同样，在缺血再灌注心肌损伤研究中，MSCs外泌体也可以减少梗死面积，改善心脏功能[8]。在心力衰竭研究中，白介素-1β在诱发心力衰竭发病中起重要作用，而MSCs能够分泌高水平的白介素-1受体拮抗剂，从而调控心力衰竭的发生[9]。这些研究揭示了在心血管疾病中，MSCs外泌体通过抑制炎症反应发挥心肌保护作用。

2.3 抗心肌重构

心肌重构是各种心血管疾病的代偿方式，比如最常见的心力衰竭后心脏扩大和心肌纤维化，往往缺乏有效的治疗方法[10]。自体MSCs移植能够减少心肌梗死面积、改善心肌重构[11]，从而进一步提高心脏功能。

心肌重构在动物实验中往往采用左心室大小、心肌纤维化、心肌细胞凋亡等指标，研究发现骨髓MSCs外泌体通过激活促存活信号，减少氧化应激来增强心肌细胞活力，防止心肌缺血再灌注损伤后的不利重构。在MSCs治疗心力衰竭的临床研究中，干细胞主要通过旁分泌作用促进内源性心脏修复，改善心肌重构[12]。前期对转基因扩张型心肌病心力衰竭小鼠进行MSCs治疗，发现干细胞移植组小鼠高表达血管内皮生长因子和胰岛素样生长因子-1，这也证实了旁分泌作用在改善心肌重构中的关键作用[13]。虽然MSCs外泌体抗心肌重构的作用是明确的，但是其具体机制仍然不清楚，需要进一步的基础研究证实。

2.4 促进血管新生

心力衰竭时，各种病理微环境下诱导心肌细胞坏死和凋亡，相应的药物治疗、手术治疗、介入治疗方法有限。MSCs和心脏干细胞分化促进血管新生成为新的治疗方法，心脏前体细胞释放外泌体能够诱导心肌细胞再生和促进内皮细胞迁移、诱导血管新生[14]。其中MSCs和心脏干细胞联合应用比单一MSCs更加能够减少心肌梗死面积，改善心功能[15]。血管新生成为干细胞外泌体治疗心血管疾病的研究靶点。然而对于促进细胞新生在传导系统、心房肌、心室肌之间的变化差别无相关的研究，这将是一个新的研究方向。

3 外泌体与心血管疾病

3.1 心肌梗死

心肌梗死是心脏冠状动脉血管的急性或慢性堵塞，引起心肌细胞凋亡、坏死。干细胞治疗心肌梗死研究最多、最充分，MSCs移植到梗死心肌能够改善心功能，这与MSCs修饰上调miR-1、促进MSCs生存和分化为心肌细胞有关。在心肌缺血微环境下，有趣的是MSCs外泌体包括上调的miR-22，可靶向结合甲基CpG结合蛋白2以抗心肌细胞凋亡。再者，外泌体同样可以抗心肌纤维化，这些意味着心肌梗死时干细胞外泌体发挥了心脏保护作用[4]。同时认为存在一个外泌体调节系统，能够促进保护因子、蛋白向梗死组织迁移，发挥保护作用，促进心肌细胞及血管新生修复[16]。

目前，干细胞外泌体治疗心肌梗死的研究往往在动物实验中进行，心肌梗死后外泌体治疗时间从心肌梗死后即刻至1周内均有相关的研究，最终改善心脏功能的机制与旁分泌作用相关，主要是外泌体改善了心肌梗死微环境，通过促血管新生、抗凋亡等机制改善心肌重构，提高心脏功能。

3.2 缺血再灌注损伤

大量研究证实缺血再灌注损伤时，由于过多自由基产生，导致不可逆的结构损伤和器官功能障碍[17]；尽管维生素E和类似物作为抗氧化剂，能够抗缺血再灌注损伤，但其作用有限，很少在临床应用。MSCs能够促进血管新生，减少梗死面积，改善左心功能，作为治疗缺血再灌注的新方法，在缺血再灌注之前5 min至再灌注后1周内使用，结果显示MSCs分泌外泌体能够减少氧耗应激，提高ATP、NADH，控制炎症，激活PI3K/Akt通路[8]，从而保护心肌细胞生存，改善左心功能，这些均提示外泌体可作为缺血再灌注损伤的治疗方法。

3.3 肺动脉高压

肺动脉高压是一种肺血管压力增高的疾病，引起右心衰竭甚至死亡。缺氧引起的肺部炎症和高氧所致肺发育不良可能是肺动脉高压的机制。研究发现MSCs比目前临床应用的药物更加能够改善肺动脉高压的预后，并且在肺动脉高压的大鼠实验中得到反复验证，揭示了其作用机制：减少肺血管重构和炎症，促进血管生成，改善肺毛细血管的通透性[18]。

肺动脉高压后的肺血管重构与缺氧诱发的肺部炎症密切相关。MSCs外泌体能够抑制缺氧信号通路的激活，平衡靶向Th1/Th2及下调增殖的miR-17(miR-17能够升高右心室收缩压，促进右心室肥厚)，最终抑制肺动脉高压。另外，外泌体干扰信号传导及转录激活因子3(STAT3)-miR204-STAT3反馈系统，改善血管重构。上述研究结果证明干细胞外泌体通过抑制早期肺部炎症反应和改善血管重构来抗肺动脉高压。

4 外泌体治疗心血管疾病的未来和挑战

自从发现外泌体后，外泌体治疗心血管疾病引起了人们的广泛关注，MSCs外泌体在治疗心血管疾病包括心肌梗死、肺动脉高压、缺血再灌注损害中发挥重要作用，机制涉及到抗心肌细胞凋亡、促进再生修复等，其中深入的机制需要进一步的研究。

与传统的干细胞移植比较，外泌体治疗具有更小的创伤，减少了异常分化的可能性(比如干细胞分化为骨、脂肪，甚至肿瘤)。因此，体外纯化的外泌体移植比单纯干细胞移植更加具有吸引力，外泌体的作用更多归功于miRNA、蛋白、功能性细胞因子。然而如何保证这些有益的细胞因子、蛋白、miRNA定向向损伤组织归巢是目前的巨大挑战，也是未来研究外泌体的关键。随着MSCs外泌体的产生、机制及作用的研究，干细胞外泌体必将成为有前景的治疗心血管疾病的策略。