MicroRNA在心肌纤维化中的研究进展

2018-02-13朱永翔李烽张耀庭王彤综述龙明智审校

心血管病学进展 2018年6期

朱永翔李烽张耀庭王彤综述龙明智审校

(1.南京医科大学，江苏南京211166；2.南京医科大学第二附属医院心血管内科，江苏南京210011)

心功能的维持依赖于心脏的收缩和舒张，而该过程由心肌细胞的功能和细胞外基质(extracellular matrix，ECM)决定。心肌纤维化是心脏成纤维细胞(cardiac fibroblasts，CF)激活后，合成和分泌过多的ECM如Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白(collagen 1，Col-1；collagen 3，Col-3)等沉积于心肌组织中[1]。过量的ECM沉积会导致心肌僵硬、心律失常和心功能下降，是缺血性心脏病、高血压、心肌病等发生心脏重构重要的病理学基础，其最终的结局是心功能衰竭。因此，抑制ECM过度沉积是预防心肌纤维化、避免心功能衰竭的重要措施，也是当前心血管领域研究的热点之一。

MicroRNA(miRNA，miR)是一类序列高度保守的内源性单链非编码小分子RNA，由21～23个核苷酸组成。原始miRNA在细胞核内RNA酶Drosha的作用下形成前体miRNA，之后前体miRNA被转运至细胞质，并在另一种RNA酶Dicer的作用下成为成熟的miRNA。成熟的miRNA可在转录后水平特异性地识别并结合mRNA的靶位点——3’端非编码区，通过抑制或降解特定靶基因的mRNA而发挥调节蛋白质合成的作用。目前，在人类基因组中已鉴定出 2 000 多种 miRNA，参与60%以上基因的表达调控。

miRNA与心血管疾病的关系密切[2]，近年来大量研究证实，miRNA在动脉粥样硬化、心肌梗死、心肌肥厚、心律失常、心力衰竭等心血管疾病的病理机制和发展演变中扮演了重要角色。在心肌纤维化方面其分子机制更为复杂，近年来与心肌纤维化相关的miRNA不断被发现，其在心肌纤维化病理进程中的调控机制也逐渐被认识。现就miRNA在心肌纤维化中的研究进展，包括miRNA作为心肌纤维化的生物学标志物、miRNA调控心肌纤维化的信号通路，以及miRNA成为心肌纤维化的潜在治疗靶点等方面做一综述。

1 miRNA作为心肌纤维化的生物学标志物

既往研究表明，循环miRNA可作为多种心血管疾病的生物学标志物。考虑到心肌纤维化过程受到miRNA的调控，近来研究者对心肌纤维化患者的循环miRNA水平进行了检测，数个miRNA分子脱颖而出，其含量的变化被证实与心肌纤维化相关，可作为心肌纤维化的候选生物学标志物。

在小鼠模型中，miR-21与压力超负荷引起的心肌纤维化有关。受此启发，Villar等[3]在主动脉狭窄患者中研究了压力超负荷诱导的ECM非适应性重构与miR-21的关系，以及miR-21作为反映心肌纤维化病理状态生物学标志物的价值。结果发现，主动脉狭窄组与对照组相比，心肌和血浆中miR-21水平明显更高，且与超声心动图显示的跨瓣压差直接相关。另外，多元线性回归提示，心肌胶原表达程度可以通过心肌或血浆中的miR-21所预测。由此可见，miRNA不仅调控主动脉狭窄患者压力超负荷后心肌纤维化的过程，更是在预测和评价心肌纤维化方面具有重要价值。

除了主动脉狭窄压力超负荷患者，Roncarati等[4]还检测了肥厚型心肌病患者血浆中一系列miRNA的表达水平，并进一步确定了其中可以作为心肌纤维化生物标志物的miRNA。检测发现，肥厚型心肌病患者血浆中有多种miRNA表达明显升高，而其中仅miR-29a的水平同时与心肌肥厚和心肌纤维化相关。研究者强调因为miR-29a的表达不具有心脏特异性，若将其作为心脏重构与纤维化标志物，还需进一步明确miR-29a在不同细胞类型中的表达差异。

类似的还有Fang等[5]也评估了miRNA作为肥厚型心肌病患者弥漫性心肌纤维化生物学标志物的价值。结果发现，与健康对照组相比，弥漫性心肌纤维化患者血浆中表达水平明显增加的miRNA多达14种。ROC曲线分析发现单个miRNA对于诊断弥漫性心肌纤维化具有中等强度的预测力[曲线下面积(area under curve，AUC)0.663～0.742]。而logistic回归分析提示miRNA联合检测可提高预测力，采用向后逐步选择法建立logistic回归模型，模型提供了8个miRNA联合(miR-18a-5p、miR-30d-5p、miR-21-5p、miR-193-5p、miR-10b-5p、miR-15a-5p、miR-296-5p和miR-29a-3p)作为预测指标，具有高度的预测力(AUC=0.87)。

2 miRNA调控心肌纤维化的机制

研究发现，多种miRNA通过不同通路参与了心肌纤维化的调控；但目前研究证据充分的miRNA并不多，miR-21、miR-24、miR-29、miR-208、miR-214等是研究较多的几种。另外，其他多个miRNA调控心肌纤维化的机制虽有研究，但尚需进一步证实。

miR-21促心肌纤维化的机制得到了充分的研究。Dong等[6-7]的报告均证实，抑制CF中miR-21/细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)信号通路具有抗心肌肥厚和纤维化的作用。研究者[8]还发现过表达miR-21会上调抗凋亡基因Bcl-2的表达，减缓纤维化心肌细胞的凋亡，推动射血分数保留的心力衰竭的发展。此外，Cao等[9]证实细胞黏附分子1是miR-21潜在的靶标。miR-21能增强CF中信号传导及转录激活因子3通路，通过抑制细胞黏附分子1的表达促进纤维化进展。

心肌纤维化被认为是心血管事件链中心肌梗死发展为心力衰竭的关键因素。有报道指出[10]，心肌梗死后心脏中miR-24表达会下调，且miR-24水平的变化与ECM重构关系密切。体外试验中，miR-24过表达会减弱转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)分泌和信号传导蛋白Smad2/3磷酸化，妨碍CF的分化和迁移，降低纤维化程度。生物学信息分析证实控制TGF-β活化的furin蛋白是miR-24的潜在靶点。研究提示miR-24通过furin/TGF-β信号途径调控心肌梗死后的CF功能和纤维化进展。

MiR-29家族直接作用于ECM中不同蛋白的mRNA，具有很强的抗纤维化作用[11]。抑制大鼠CF中miR-29a的表达会上调miR-29a靶蛋白血管内皮生长因子A(vascular endothelial growth factor A，VEGF-A)表达。而CF转染miR-29a模拟物后则出现相反的结果，且抑制了CF的增殖。据此推测miR-29a通过VEGF-A/丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)途径实现对心脏纤维化的抑制[12]。Yang等[13]发现，丹参酮可以上调CF中miR-29b的表达，抑制TGF-β信号通路，并下调Col-1、Col-3和α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)的表达。而经Smad3 的小干扰RNA(siRNA)处理的CF会显著抑制miR-29b的表达，阻碍丹参酮的抗纤维化作用。这表明抑制TGF-β/Smad3通路是miR-29b抗纤维化的机制。另外，miR-29b还靶向影响胶原、基质金属蛋白酶、胰岛素样生长因子-1和穿透素-3等参与纤维化的蛋白分泌，发挥抗纤维化作用[14]。关于miR-29c的抗纤维化作用，Liu等[15]发现上调miR-29c表达,可抑制异丙肾上腺素诱导的心肌损伤和纤维化，此过程中miR-29c调控的靶基因包括胶原蛋白家族、纤连蛋白1和TGF-β。Lew等[16]发现脂多糖诱导心肌梗死后，miR-29c对心脏纤维化的作用与TGF-β并不相干，而与促进NADPH氧化酶2和基质金属蛋白酶组织抑制剂-1的表达有关，这可能是miR-29c调节脂多糖诱导心脏纤维化的独特机制。

Wang等[17-18]分别在容量超负荷心力衰竭模型和急性心肌梗死模型中证实，miR-208a通过增加内皮因子表达诱导了心肌纤维化。Zhou等[19]的研究中，上调miR-208b水平可以显著改善心肌梗死后的心脏功能，并抑制Col-1和α-SMA表达(P<0.01)。荧光素酶报告基因检测证实转录因子GATA4是miR-208b直接的靶点，miR-208b通过抑制GATA4，下调Col-1和α-SMA发挥抗纤维化作用。

Sun等[20]发现，下调异丙肾上腺素处理的CF中miR-214的表达会抑制ERK1/2-MAPK信号，延缓CF增殖和胶原分泌。线粒体融合蛋白2被认为是miR-214的直接作用靶点，miR-214通过抑制线粒体融合蛋白2表达和活化ERK1/2-MAPK信号介导调节CF增殖和胶原分泌。Dong等[21]的研究中，上调miR-214能减缓血管紧张素Ⅱ诱导或心肌梗死后出现的心脏纤维化，并降低胶原聚集、TGF-β1和基质金属蛋白酶抑制剂-1表达。表明miR-214通过调节TGF-β1和基质金属蛋白酶抑制剂-1等因子表达，抑制纤维化而具有心脏保护作用。

研究还发现，miR-18a-5p通过抑制Notch信号通路，调控高糖诱导的内皮细胞间质转化，减轻糖尿病心肌病心肌纤维化程度[22]。Wei等[23]证实miR-26a过表达能抑制核因子-κB活性，减弱Col-1和结缔组织生长因子的表达，发挥抗纤维化作用。此外， miR-15[24]、miR-98[25]等也通过抑制TGF-β1信号，发挥抗心肌肥厚和纤维化作用。而miR-34a、miR-155[26]等却会增加TGF-β1在CF中的致纤维化活性[27]。其中，靶向影响Smad4表达是miR-34a促纤维化的基础。miR-155对TGF-β1/Smad2信号通路的调控具有特异性，其他Smad不受miR-155调控。

3 miRNA成为心肌纤维化治疗靶点

多个动物实验研究表明，通过下调miRNA表达、干扰正常miRNA的功能，或是借助模拟物增强miRNA对靶基因的作用效果，心肌纤维化的程度与心功能可得到一定改善[28-29]。因此，将miRNA作为治疗靶标，通过人工调节miRNA表达，有望成为抗心肌纤维化治疗极具潜力的新策略。

目前，基于miRNA的抗心肌纤维化治疗尚存在诸多有待解决的问题。例如单个miRNA可以作用于不同器官中的多个靶基因，而同一个靶基因也会受到不同miRNA的调控，即miRNA表达大多不具备器官和组织特异性，这使得调控miRNA治疗纤维化较为复杂，且存在“脱靶”效应等局限。因此，在该方法应用于治疗心肌纤维化和心脏重构之前，理解相关miRNA参与心肌纤维化的调控网络，从而实现局部靶向治疗相当重要。另外，miRNA模拟物是与前体miRNA类似的双链复合体，其缺点主要是细胞摄取双链RNA的能力有限，以及RNA模拟物必须要被合并到RNA诱导的沉默复合体中才能实现生物学活性，而RNA模拟物一旦过度表达则会造成RNA诱导的沉默复合体饱和，对内源性miRNA正常的生理功能形成干扰[30]。

总之，miRNA在心脏纤维化中的调控作用还未明了，而基于miRNA的抗心肌纤维化治疗也缺乏临床证据支持。就靶向治疗而言，目前miRNA局部传输释放系统(如释放miRNA的可降解支架以及囊泡包装的miRNA等)的研发已取得了显著的进展。另外，促融合脂质、阴离子脂质和两性脂质复合体等辅助分子，也被用来改善miRNA传输的效率和组织特异性。这些技术都为通过调节体内miRNA水平从而预防和治疗心肌纤维化提供了巨大前景。