脂肪间充质干细胞对T细胞的免疫调节作用及其应用

李春华，江霞，许兆军宁波市第二医院重症医学科，浙江宁波 315010

间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）是一组多能间充质基质细胞，国际细胞治疗协会间充质和组织干细胞分会对MSC的定义包括：标准培养条件下贴壁生长；高表达CD105、CD73和CD90，不表达CD45、CD34、CD14 或 CD11b、CD79α 或 CD19 和HLA-DR；体外标准培养，能在不同分化条件下分化成骨、脂肪和软骨等组织细胞[1]。MSCs来源广泛，可从骨髓、血液、脂肪组织和脐带等多种组织中分离获得，其中从脂肪组织中分离获得的脂肪间充质干细胞（adipose-derived mesenchymal stem cells,ADSCs）具有多向分化潜能、免疫调控能力和自主更新能力，其生物学特性与骨髓间充质干细胞相似[2-3]。

1 ADSCs的生物学特性

ADSCs具有脂肪组织来源广泛易获取、取材过程创伤小、含量丰富且提取率高、不受伦理限制等诸多优势，使其成为再生医学领域中重要的种子细胞[2]。脂肪组织中多能干细胞的含量丰富，与骨髓分离相比，脂肪组织分离可获得更多的干细胞[1]。每克脂肪组织可以分离获得约 5×103～2×105个 ADSCs，不同患者的脂肪组织获得的ADSCs的数目也不尽相同[1]。ADSCs的免疫表型与其他组织来源的MSCs相似，也表达MSCs特异性表面抗原如 CD90、CD105、CD73，而不表达造血干细胞表面抗原如CD45、CD34和人类白细胞DR 抗原（HLA-DR）[2]。 ADSCs来源于中胚层，拥有多向分化能力，因而能在一定条件下分化成骨、脂肪、软骨、心肌、肌及其他中胚层等组织细胞[4]。ADSCs的增殖、分化能力不随供者年龄的增长而出现明显下降趋势，并且多次传代后仍具有稳定的增殖能力，其增殖能力比BMSCs更强[5]。不同组织的脂肪提取培养的MSCs的分化潜能有所不同，分化机制亦不相同[6]。此外，ADSCs分泌的吲哚胺-2,3-双加氧酶（IDO）活性水平明显高于BMSCs，也因此具有更强的免疫调节能力[7]。

2 ADSCs对T细胞的免疫调节作用

T细胞是淋巴细胞的主要组分，主要来源于骨髓中的多能干细胞，这些干细胞迁移到胸腺内，再由胸腺激素诱导，随后分化、成熟，最后成为有免疫活性的T细胞。

ADSCs因不表达或极低表达关键的免疫相关分子如DR白细胞抗原而具有很强的免疫调控作用。主要组织相容性复合物 （major histocompatibility complex,MHC）-II类分子主要存在于外源性抗原中，是介导同种异体免疫排斥反应的主要分子之一。ADSCs表面不表达MHC-II类分子，因而具有较低的免疫原性，也因此具有免疫耐受的特点。ADSCs的低免疫原性与其直接抑制T细胞及其分泌细胞因子形成的免疫抑制微环境有关[7-8]。

2.1 ADSCs对活化T细胞的免疫调节作用

炎症条件下，ADSCs抑制活化T细胞的增殖过程即为ADSCs对活化T细胞的负性免疫调节。共培养ADSCs与T细胞，发现随着二者共培养比例的增加，ADSCs对活化T细胞增殖的抑制率也显著升高，并呈剂量依赖关系。此外，王平等在干扰素（IFN）-γ增强ADSCs对淋巴细胞的免疫调节作用的研究中发现，与未刺激组相比，IFN-γ预刺激ADSCs可显著增强其对T细胞的负性免疫调节，也呈剂量依赖关系。该研究发现，IFN-γ刺激后的ADSCs内IDO mRNA的表达水平也显著升高[9]。

IDO是一种含亚铁血红素的单体酶，也是体内色氨酸代谢产生犬尿氨酸途径的关键限速酶。目前认为，ADSCs分泌IDO参与免疫调节过程的分子机制是IDO能通过色氨酸耗竭或者下游色氨酸代谢产物介导对T细胞增殖的直接抑制作用[7]。IDO增加能使活化T细胞的增殖能力受到明显抑制，采用IDO阻断剂1-MT可降低其对活化T细胞增殖的抑制能力，表明IDO在ADSCs介导的对活化T细胞的负性免疫调节过程中起重要作用。研究发现，IFN-γ预刺激组中CD4+CD25+Treg的比例较未刺激组高，表明ADSCs能够诱导活化T细胞，并使其向CD4+CD25+Treg亚群转化，而IFN-γ预处理能够增强ADSCs的这种能力[10]。

2.2 ADSCs对辅助性T细胞的免疫调节作用

CD4+T细胞也参与机体的免疫应答过程，并且其能参与辅助机体B细胞分泌抗体、维持机体免疫耐受过程，还能调节机体抵抗病原体等。辅助性T细胞如Th1、Th2及Th17等亚群是由初始CD4+T细胞活化之后分化而来。已有研究表明，ADSCs具有调节Th1[3,11]、Th2[11]及 Th17[12]辅助性 T 细胞的作用。

2.2.1 对Th1细胞的作用 初始CD4+T细胞经IL-12刺激后可分化成Th1细胞，该类细胞是较早被发现的CD4+T细胞中的其中一个亚群。Th1细胞能帮助机体防御病毒、细胞内细菌及真菌感染，其主要分泌 IFN-γ、IL-2、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等促炎细胞因子。这些细胞因子可通过激活巨噬细胞、自然杀伤细胞及CD8+T细胞，通过调节细胞免疫反应，增强免疫细胞对细胞内病原体的杀伤能力，引起迟发型超敏反应，导致组织损伤[13-14]。ADSCs能够抑制Th1细胞增殖，也能抑制其相关细胞因子分泌，并且在该过程中，ADSCs可以对其进行直接抑制，也能对其进行间接抑制。就直接抑制而言，ADSCs可通过分泌IDO，抑制与Th1细胞极化密切相关的因子，如特异性转录因子T-bet、信号转导与转录激活因子1和4等的表达，最终使初始CD4+T细胞分化成Th1细胞亚群的这一过程受到抑制。就间接抑制而言，研究表明，ADSCs能够通过促进树突状细胞免疫耐受、诱导CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞产生等过程，达到抑制Th1细胞免疫应答的目的[13,15,16]。

2.2.2 对Th2细胞的作用 Th2细胞是较早被发现的CD4+T细胞中的另一个亚群，IL-4能够驱使并诱导初始CD4+T细胞分化成该细胞亚群。Th2细胞主要分泌IL-4、IL-5和IL-13等细胞因子，其主要目的是清除细胞外病原体。Th2细胞能通过诱导机体产生和分泌特异性抗体，同时使嗜酸性粒细胞聚集到炎症区域，并协助激活B细胞参与体液免疫的调节过程。Th2细胞在介导某些疾病的炎症反应过程中，可通过募集大量的嗜酸性粒细胞，导致炎症的发生，进而产生疾病[16-17]。对小鼠过敏性鼻炎的研究发现，就对变应原的免疫应答方面，ADSCs可以把Th2细胞转变为Th1细胞，从而使小鼠过敏性鼻炎的临床症状得到有效改善[18]。

然而，在以Th1和Th17细胞为主要炎性因子的疾病，如多发性硬化及慢性血小板减少等疾病过程中，ADSCs能抑制Th1、Th17而增强Th2等细胞亚群的免疫应答，从而使前两者主导炎症反应更改为由Th2细胞亚群主导，以达治疗目的。但ADSCs的作用机制尚缺少更加有力的证据，目前的研究认为存在直接接触和旁分泌作用[19-20]。

2.2.3 对Th17细胞的作用 Th17细胞是一类新型的CD4+T细胞亚群，其分化机制和功能特征与Th1及Th2细胞不一样。Th17细胞能够分泌一些细胞因子，主要有 IL-6、IL-17A、IL-17F、IL-21 等。 IL-6 与转化生长因子 （TGF）-β 或联合IL-1、IL-21和IL-23等，共同诱导初始CD4+T细胞，使其进一步分化为Th17细胞，以促进机体对胞外病原体的免疫应答。Th17细胞特异性转录因子维甲酸相关孤儿受体（ROR）γt和RORα是调控Th17细胞亚群分化过程中的关键转录因子[21]，其中RORα主要起协同RORγt的作用，在诱导促炎细胞因子TNF-α、IL-1β等、基质金属蛋白酶、CXC趋化因子的表达中起重要作用。此外，Th17细胞亚群的这两种关键转录因子对中性粒细胞的增殖、成熟和趋化等过程很重要[22-23]。已有研究结果表明，ADSCs可以抑制Th17细胞亚群的免疫应答，这其中涉及了不同的机制[24-25]。大量研究认为，ADSCs诱导免疫耐受是通过对CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞的扩增实现的，已达到间接抑制Th17细胞免疫应答的目的。但一些研究表明，ADSCs在抑制初始CD4+T细胞分化成Th17细胞的过程中，可以通过直接作用于一些信号转导通路达到抑制目的，并且这些通路与IL-23受体相关[20-22]。此外，也有一些研究表明，在体外条件下，ADSCs可被IL-1β激活，导致Th1的表达受到抑制，从而使Th17细胞亚群数量增多。由此可见，ADSCs的周围环境可影响其免疫调节作用[26]。另外，也有研究表明，ADSCs能抑制Th17细胞特异性转录因子RORγt的表达和Th17细胞亚群功能，并诱导Treg细胞特异性转录因子Foxp3的表达等机制，但该机制是否存在，尚待研究[27]。

2.3 对调节性T细胞的免疫调节作用

调节性T细胞 （Regulatory T cell,Treg）细胞是CD4+T细胞的一个亚群，总量约占T细胞的5%。TGF-β可以刺激初始CD4+T细胞，并诱导其生成Treg细胞。Treg细胞在机体中起负性免疫调节作用，对辅助性T细胞的亚群起抑制作用。Treg细胞也能抑制其他的免疫反应，以及炎症反应的激活等过程[28]。有研究表明，骨髓间充质干细胞能够分泌免疫抑制因子TGF-β，也能使CD4+CD25+T细胞表达增加，更能抑制IFN-γ和IL-4等促炎因子的分泌[29]。ADSCs可促进Treg细胞的扩增和活化，从而发挥负性免疫调节作用。ADSCs的这一作用已在移植物抗宿主病、类风湿性关节炎等多种疾病模型中得以证实[30]。目前的研究认为，在调节Treg细胞扩增过程中，ADSCs分泌的可溶性细胞因子如IDO、白血病抑制因子（LIF）等也起一定作用[31]。此外，体内炎症反应过程中，Treg细胞可以被ADSCs诱导产生，并且产生的Treg细胞能促进CD4+T细胞分化成促炎表型。以上表明，在炎症条件下，Treg细胞可以转化成Th17细胞亚群[21,32]。然而，目前尚无文献报道，仍需进一步的研究。

3 ADSCs的应用

ADSCs已被广泛地用于动物模型、软组织修复、同种异体移植及其他临床研究中[33-34]。肖二彬等人[35]在小鼠变应性鼻炎的研究中发现，高剂量ADSCs组与卵清蛋白/卵清蛋白组比，血清和脾脏IL-4、IL-6表达显著降低，而IL-10与IFN-γ表达明显升高；低剂量ADSCs组与卵清蛋白/卵清蛋白组比，血清和脾脏IL-6表达显著降低，IL-10表达明显升高，而IL-4与IFN-γ表达无显著性变化。经ADSCs移植治疗后，发现小鼠血清中IL-4与IL-6水平降低，IFN-γ水平升高，表明ADSCs可通过调节Th1/Th2的免疫失衡及Treg细胞缺陷使小鼠变应性鼻炎的T细胞免疫状态得到改善。该研究也发现，高、低剂量ADSCs均能使IL-10表达升高，但高低剂量之间存在差异，表明IL-10调节Treg细胞的免疫缺陷具有剂量依赖性[36]。

王椋等人[37]在体外共培养ADSCs与再生障碍性贫血患者T淋巴细胞7 d发现，与再生障碍性贫血T淋巴细胞组相比，Th1 类细胞因子（IFN-γ、IL-2）及其特异性转录因子T-bet表达降低，Th2类细胞因子（IL-4、IL-10）及其特异性转录因子GATA-3表达升高，提示人类ADSCs在体外可能通过调节T-bet和GATA-3[21]的表达抑制辅助性T细胞分化成Th1细胞，进而对再生障碍性贫血患者T淋巴细胞进行免疫调节。

此外，ADSCs也能治疗肿瘤相关疾病，如孔志华等人[38]发现ADSCs可以影响辐射诱发的小鼠胸腺瘤的免疫功能。由于机体各功能细胞对放射线的敏感不同，造成功能细胞亚群在辐射后重新分布，从而导致辐射后机体免疫抑制的发生。研究表明，CD8+T细胞的放射敏感性较CD4+T细胞高，但由于CD8+T细胞增殖较快，因而CD4+T细胞在辐射后明显降低，而CD8+T细胞的升高，造成免疫功能紊乱。该研究发现，注射ADSCs的照射组小鼠的胸腺淋巴细胞转化率和胸腺指数与单纯照射组相比显著升高，且CD4+T细胞的含量也明显增加，而CD8+T细胞则明显降低，CD4+/CD8+T细胞比值显著升高。CD4+/CD8+比值降低与病变程度密切相关，通常提示机体识别和杀伤突变细胞的能力较之前下降，进而促进肿瘤的生长和转移[39]。以上表明，ADSCs可能通过调节小鼠胸腺内细胞含量的变化，保护小鼠胸腺细胞的免疫功能。

4 ADSCs面临的挑战与展望

干细胞应用到临床治疗过程需要同时满足：取材简单、培养方便，并能在体外进行大量增殖；不受伦理限制；临床安全性高，同时具备较低的致瘤风险；大样本、多中心，并且经临床随机对照实验证实其疗效真实可靠。尽管关于ADSCs的研究已经从基础研究转向临床研究，但目前为止，ADSCs远不能达到规模化用于临床治疗疾病。尽管ADSCs具有取材方便、不受伦理限制、体外能够稳定增殖分化等优点，但其仍不同于普通的临床药物。此外，不同的研究单位的制备方法及质量控制方面也有所不同。因此，建立ADSCs标准化的培养体系、质量控制体系及特异性分子标记物势在必行。与此同时，ADSCs移植的最佳剂量、移植途径及给药时间等方面也需要严格的控制和规范，以达到高效安全的应用到临床治疗中。

ADSCs由于具有多向分化潜能、来源广泛、取材过程痛苦小并能在体外稳定增殖等特点使其在骨骼肌肉系统疾病、自身免疫性疾病、移植物抗宿主病等[3]多种疾病的治疗方面具有广阔的临床应用前景。尽管ADSCs在基础研究方面已经进行了大量的动物实验，但距其真正运用到临床治疗疾病仍有很大一段距离，还需要大量更为深入的研究进行支持。

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