布鲁氏菌病亚单位疫苗研究进展

夏嘉跃，殷德辉徐州医科大学公共卫生学院，江苏徐州 221004

布鲁氏菌病（brucellosis）是革兰氏阴性菌——布鲁氏菌所引起的人兽共患传染病，简称布病，是我国法定的乙类传染病。目前，布病在全球范围内仍然有较高的发病率及流行趋势，对人畜的健康安全构成危害。在欧洲等许多发达国家和地区，虽然公告消灭了布病，但是近年来随着经济全球化的发展，布病作为一种旅游输入传染病，其呈现出死灰复燃的趋势，而在一些发展中国家或地区如非洲、中东、拉美以及亚洲的部分地区，布病仍然没有被较好地控制，发病和流行较为严重[1]。目前布鲁氏菌病的诊断较为困难，如不能及时诊断治疗，可导致感染进一步损伤人体系统，引起严重并发症，甚至死亡。由于布病对畜牧养殖业以及人体健康安全构成了严重威胁，因此积极开展预防布病工作具有重要意义，当前疫苗接种是防控布病的主要手段。目前研发的布鲁氏菌的疫苗种类很多，减毒活疫苗已经被广泛应用牛羊猪等家畜，但减毒活疫苗毒性一般比较高，可造成怀孕家畜的流产，此外，利用普通的血清学检测无法区分自然感染和接种疫苗的牲畜，增加了诊断的难度[2]。对于突变菌株而言，虽然对宿主具有一定的保护作用，但是从安全和性质方面考虑，仍然存在着不确定性，可能存在回复突变而致病性增强，应用受到很大限制。因此，无安全隐患且具有较好保护作用的亚单位疫苗成为了布病研究的新热门。当下关于布鲁氏菌亚单位疫苗的研究主要概括为如下几个方面。

1 DNA亚单位疫苗

DNA疫苗是将能够表达特定目的基因的DNA质粒注射入宿主中，其在宿主体内开始转录和翻译，最终表达出抗原物质，产生特定的免疫反应，从而构造出具有选择性的疫苗。DNA疫苗具有很多优点，比如较高的安全性和功效性、室温稳定性等[3]。

通过归纳总结先前研究的成果，目前DNA疫苗主要有基于 Omp31、Omp25、L7/L12、p39、核糖体蛋白L9及GroEL等为靶标的基因[4-6]。有研究利用布鲁氏菌核糖体蛋白L7/L12和外膜蛋白omp31设计出了pcDNA-L7/L12-Omp31的二价DNA疫苗，实验研究发现，该疫苗引起T细胞的大量增加，并且使机体产生干扰素，其免疫保护程度明显高于单价疫苗[7]。

目前许多研究已经表明DNA疫苗可以引诱机体产生较强的细胞毒性反应和Th1反应，对多种微生物具有一定的保护作用。并且，对于DNA疫苗来说，由于其没有致病性增强的现象，所以其安全性有所保障。然而，到目前为止尚未发现单价DNA疫苗效力优于传统疫苗。对于DNA疫苗而言，其产生的细胞免疫反应相对蛋白质疫苗要更加显著，具备较好的研究开发潜力。

2 LPS

近些年来，布鲁氏菌如脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）成为研制布鲁氏菌亚单位疫苗的备选物。从先天免疫的角度来看，布鲁氏菌脂多糖被认为是最重要的抗原之一。

Siadat等[8]设计出用牛型布鲁氏菌S99的脂多糖和血清组B类脑膜炎双球菌的外膜囊泡进行共轭结合来构成布病亚单位疫苗，实验结果显示，注射LPS-外膜囊泡（outer membrane vesicles,OMVS）共轭物后，机体产生的IgG效价明显高于单独LPS和LPS与OMV非共价键联合。在随后的加强免疫研究中，相对于其他参照组，LPS-OMV共轭物都显示出更强的效价，实验结果证明共轭的LPS可以作为布病疫苗，但仍须要更深入的调查研究。关于脂多糖作为轭合物的成分的使用，受到很多因素的影响，这些因素主要包括共轭的成分、蛋白质载体、免疫接种路径、佐剂、动物物种和检测方法等[9]，都可以致使体内发生差异性的抗体反应。Rokhsartalab-Azar等[10]设计出了以LPS为基础的共轭疫苗，报道了这些共轭化合物在实验小鼠体内引起的高浓度抗体反应。这些研究均显示了LPS作为共轭物成分研制出新布病共轭物疫苗的可行性以及有效性，但仍需要进一步的研究。

3 蛋白质疫苗

当前用于布鲁氏菌病亚单位疫苗研究的蛋白包含有转铁蛋白Bfr、外膜蛋白、分子伴侣DnaK、Cu-Zn超氧化物歧化酶、水解酶、糖激酶等[11-12]。许多针对蛋白质的重组疫苗研究已经开展，也取得相应的成效。构建重组蛋白质疫苗的关键是挑选出最佳的抗原，后期常与各种佐剂结合起来使用，能刺激机体产生免疫应答反应，相比之前而言，反应更加强烈。实验研究结果显示，Omp16和Omp19在一定程度上都能够刺激机体，使其产生Th1型的免疫反应，且能够提供与现有疫苗S19和RB51相当的保护作用。此外，对外膜蛋白Omp25、Omp28和Omp31的开展研究，也获得类似的成果[13-16]。随着重组蛋白疫苗研究的进一步深入，相信布鲁氏菌的膜外蛋白具有为其研究提供合适目标蛋白的潜力。

随着对外膜蛋白研究的进一步深入，多肽疫苗作为一种新型疫苗被研发出来，免疫效果优良。同时，随着网络技术的发展，免疫信息学分析作为一种新型标准的筛选细胞抗原表位的手段，已经被各种实验研究大量采用。Saadi等[17]应用免疫信息学筛选出了布鲁氏菌 最有效 的免疫原性 抗 原 Omp31、BP26、BLS、DnaK和L7-L12，并从这些蛋白中选出了5个新的T细胞表位，以预测的377个氨基酸残基表位为基础设计出了多肽疫苗，实验结果表明，设计出的多肽疫苗可引起强烈的T细胞和B细胞介导的免疫反应。

虽然免疫信息学预测工具存在预测表位准确性差的问题，但是现有的表位预测工具较多，通过多个预测工具的联合可以很好的增加预测的准确性。本课题组联合利用BepiPred、ABCpred和COBEpro 3个B细胞表位预测工具，对多个布鲁氏菌外膜蛋白进行了预测，构建了多表位融合蛋白，通过动物试验，取得了很好的免疫效果，此外，T细胞表位预测工具，可以对Ⅰ和Ⅱ型主要组织相容性复合体进行预测，同时结合NetMHC version、SMM 和 Comblib等多个工具的预测结果[18]，都能够筛选合适表位进行融合处理，可用于研制构建融合蛋白疫苗，实现多价的疫苗的构建，研究结果表明，融合蛋白有望致力于提高布病疫苗的免疫效力。

与其他亚单位疫苗相对比而言，蛋白质疫苗研制的费用过高、体内无法合成并且提取程序复杂，眼下并未被大规模广泛使用。目前，构建蛋白质疫苗常见的策略是将几种蛋白，或者将多个有效的多肽进行重组，构建重组蛋白，用于布鲁氏菌疫苗的研究，该方法既可以解决多肽疫苗的半抗原缺陷，又可以增加免疫效果。

4 展望

对于亚单位疫苗的研究，只有选择合适的抗原，才能有望提高亚单位疫苗的效果，虽然很多研究已经证实了多数细菌外膜以及内部的要素，在一定程度上都可以具有作为亚单位疫苗研究的靶器官抗原的可能性，但是需要更多进一步的研究，不断探索发现新的具有保护作用的抗原，这一点对于致力于提高亚单位疫苗效力显得不可或缺[19]。

目前布鲁氏菌回升趋势仍波动不稳，尚未被完全消灭掉。不单单畜牧养殖业因此遭受极大亏损，而且人类的健康也难以得到保障，而疫苗是其治疗的最好选择。相对于传统的疫苗，亚单位疫苗安全性较高，并且无潜伏毒副作用。此外，亚单位疫苗诱导发生的免疫反应不同于受到感染所致的免疫反应，更加适合于控制和预防疾病。但是目前的亚单位疫苗仍存在着保护效果不完全的缺点，因此有针对性地选择合适的保护性抗原，并且对特定的抗原，可以选择契合的载体及辅助性的佐剂，另外，高效率的加工处理系统也很重要，这些都致力于提高亚单位疫苗的保护效力，充分发挥其优势所在，这将会是未来布病亚单位疫苗研究的新方向。

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