具有人红细胞重建的人源化小鼠模型构建和应用的研究进展

范 伟，杨永广，胡 正

(吉林大学第一医院转化医学院/免疫学研究所，吉林 长春130061)

小鼠作为一种常用的模式动物在医药领域具有广泛的应用。早在17世纪小鼠就被作为实验对象，现已成为使用量最大、研究最详尽的哺乳类实验动物之一。然而，许多药物或治疗方案在普通小鼠模型中验证有效之后，在临床试验中却有超过80%的失败率[1]。小鼠和人之间巨大的进化差异是导致普通小鼠模型无法准确反映人生理和病理情况，并预测药物的临床疗效的主要原因。因此，构建能够直接反映人类生理、病理状况的新型小鼠模型对于生物医学研究的进步具有重要意义，而人源化小鼠就是在这种环境下应运而生[2]。具有人造血免疫系统的人源化小鼠即造血免疫系统人源化小鼠，是目前最为成熟且应用最为广泛的一类人源化小鼠模型。

1 造血免疫系统人源化小鼠模型及其人红细胞发育情况

1988年McCune等[3]将人的胎肝造血干细胞、胚胎胸腺及淋巴结移植入重症联合免疫缺陷(SCID)小鼠中建立了第1个人源化小鼠模型，即SCID-hu小鼠。同年8月，PBL-SCID小鼠模型诞生，该小鼠是将人外周血单个核细胞输注入SCID小鼠中再造出人类免疫系统[4]。SCID小鼠的T细胞和B细胞几乎完全缺陷，但小鼠自然杀伤细胞(natural killer cell,NK)等其他天然免疫细胞还会高效杀伤人类细胞，严重影响基于SCID小鼠构建的人源化小鼠中人细胞的水平[2]。1995年NOD/SCID品系小鼠成功建立，NK细胞杀伤功能明显降低且巨噬细胞几乎不排斥人类细胞，是用于构建人源化小鼠模型的理想小鼠品系[5]。Lan等[6]通过在NOD/SCID小鼠上移植人胚胎胸腺和肝脏及造血干细胞(hematopoietic stem cells,HSC)构建了具有人免疫系统功能的人源化小鼠模型，又被称为BLT模型，被认为是活体研究人免疫系统及人免疫系统相关疾病的最优动物模型之一，已经被广泛应用于生物医学研究的许多领域[7]。在NOD/SCID小鼠基础上进一步发展出的NOD/SCID IL2rg-/-小鼠的NK细胞完全缺陷，被认为是目前用于人源化小鼠模型构建的最佳受体之一[2]。

2005年 Ishikawa等[8]通过脸静脉给新生NOD/SCID IL2rg-/-小鼠注射人脐带血CD34+细胞，构建了具有人T细胞、B细胞和树突状细胞(dendritic cell,DC)等免疫细胞的人源化小鼠模型，且在其外周血中检测到人Glycophorin A+红细胞。研究[9]显示：基于NOD/SCID小鼠和NOD/SCID IL2rg-/-小鼠建立的所有人源化小鼠的外周血中均无法检测到人红细胞，但其骨髓中却有大量人红系细胞，骨髓中未成熟的人红细胞的嵌合比例和人白细胞嵌合比例几乎无差别；但成熟人红细胞嵌合比例却远低于人白细胞的嵌合比例，表明某些因素阻碍了人源化小鼠模型中人红细胞的重建。

2 造血免疫系统人源化小鼠人红细胞发育障碍的原因

2.1 网状内皮吞噬系统不兼容本课题组前期研究[9]表明：小鼠网状内皮系统的吞噬是导致人红细胞无法在免疫缺陷小鼠中存活的主要原因之一。应用脂质体包载的氯膦酸二钠(clodronate-liposome,CLD-liposome)清除小鼠巨噬细胞可以提高输注免疫缺陷小鼠中的人红细胞的生存时间，注射CLD-liposome的人源化小鼠的外周血中检测到Glycophorin A+CD71—无核的成熟人红细胞，联合应用人白细胞介素3(interleukin-3,IL-3)和促红细胞生成素(erythropoietin,EPO)能明显提高人红细胞的重建比例[10-11]。但外周血中网织红细胞占人红细胞比例的10%～30%，明显高于正常人外周血中网织红细胞的比例[10]。这可能与巨噬细胞完全清除有关，因为红细胞的发育成熟脱核的过程需要巨噬细胞的参与，且巨噬细胞分泌的自身合成的铁蛋白能够促进红细胞的成熟和分化[12]。由于缺乏可用的动物模型和有效的实验检测手段，红细胞去核机制仍存在争议。

2.2 CD47-信号调节蛋白α(Sirpα)信号通路的异常CD47是一类广泛表达于细胞表面的蛋白分子，可调节具有吞噬功能免疫细胞(如巨噬细胞和DC)的吞噬作用。CD47与其配体Sirpα结合会传导一个“Don’t eat me”的免疫抑制信号[13]，在异种移植中，由于供者CD47与受者Sirpα之间的不匹配导致移植物被受体巨噬细胞排斥[14]，可能限制了人细胞在小鼠中的重建。NOD背景的免疫缺陷小鼠比较特殊，与其他品系小鼠比较，人CD47与NOD小鼠的Sirpα亲和力高出65倍，其原因是NOD小鼠的Sirpα在1结构域中缺少2个氨基酸，所以NOD背景小鼠比其他品系小鼠有更好的植入背景[15]。在NOD/SCID小鼠中1∶1转输CD47KO小鼠红细胞及人红细胞后，NOD/SCID小鼠排斥人红细胞的速度明显快于CD47KO小鼠，说明NOD/SCID小鼠排斥人红细胞不是因为CD47-Sirpα信号通路缺失[11]。随着对红细胞发育研究的深入，报道[16]指出：CD47在衰老和氧化红细胞上的表达水平及膜上分布出现异常，会促进巨噬细胞对红细胞的吞噬，推测小鼠吞噬人红细胞可能与人红细胞在小鼠体内被氧化或快速衰老有关。

2.3 补体的调理作用目前应用于人源化的受者小鼠多为NOD背景的免疫缺陷小鼠，该小鼠优势不仅在于其Sirpα与人CD47有交叉反应，而且该种小鼠补体系统不健全。NOD背景小鼠补体C5缺陷，因此不能形成膜攻击复合体介导溶细胞效应[17]。一般认为，NOD/SCID及NOD/SCID IL2rg-/-小鼠的补体系统不会介导对植入人细胞的排斥。研究[18]表明：NOD背景免疫缺陷小鼠中的补体C3可以在无抗体的情况下直接结合并调理人红细胞，介导小鼠吞噬细胞(包括巨噬细胞、中性粒细胞和内皮细胞)对人红细胞的排斥作用；在CLD-lipsome处理的人源化小鼠中，联合注射眼镜蛇毒因子(Cobra venom factor，CVF)(清除小鼠补体C3)能够将人源化小鼠外周血中人红细胞的重建水平提高约2倍,说明人红细胞在小鼠体内被清除与小鼠补体有关。

2.4 小鼠淋巴造血因子和人细胞交叉反应缺失红细胞在骨髓中的分化发育依赖一系列细胞因子作用完成，例如IL-3和EPO[19]。研究[20]表明：小鼠IL-3和人IL-3之间的同源性较低，无法作用于人类细胞。EPO在低氧条件下由肾脏产生，调节红细胞的产生[21]，其小鼠和人之间的交叉反应也不明确。研究[22]表明：通过给人源化小鼠高压注射含有人IL-3和EPO基因的质粒，4周后可在人源化小鼠外周血中检测到少量人红细胞重建。与此类似，在CLD-liposome处理的人源化小鼠体内同时注射人IL-3和EPO可以将人红细胞的嵌合比例提高约5倍[9]。因此，小鼠和人之间淋巴造血因子交叉反应缺失或不足也是限制人源化小鼠中人红细胞重建的原因之一。

2.5 骨髓微环境造血干细胞在骨髓中向红细胞分化发育除了与淋巴造血因子有关外，也与骨髓基质细胞等提供的骨髓微环境有直接关系[23]。小鼠骨髓微环境与人骨髓微环境不尽相同，所以人造血干细胞的一些属性无法在人源化小鼠中体现，例如人造血干细胞无法在免疫缺陷小鼠中实现连续移植。人造血干细胞较小鼠造血干细胞在小鼠骨髓造血龛(Niche)的竞争劣势也被认为是影响人源化小鼠骨髓中人造血干细胞定向分化的原因之一[24]。c-kit基因属于酪氨酸激酶受体蛋白家族的重要成员之一，通过与干细胞因子(stem cell factor,SCF)结合激活一系列信号通路，参与造血干细胞增殖分化的调控。c-kit基因某些突变(如c-kit/W41)会导致自身造血干/祖细胞对造血龛提供的SCF(c-kit的配体)的作用能力减弱，降低小鼠造血干细胞对自身造血龛的竞争能力[24]。因此，c-kit/W41突变的免疫缺陷小鼠(如NSGW41)可以在非照射条件下直接注射人HSC实现较高水平人造血免疫细胞的重建[24]。在NSGW41背景的人源化小鼠骨髓中多个分化阶段人红系细胞(包括Pro-E、Int-E/Late-E和Retic/RBC)的嵌合比例均明显高于基于NSG的人源化小鼠，与人骨髓中的红系细胞组成情况十分相似[25]。Fiorini等[26]利用NBSGW小鼠对人红细胞在各发育阶段的形态分析、表面表型等方面进行充分表征，结果表明：优化小鼠骨髓中人造血干/祖细胞的骨髓微环境，有助于人红细胞的分化发育。

3 具有人红细胞组成的人源化小鼠模型的构建

按照模型构建的方法划分，红细胞人源化小鼠模型的构建方法大致可分为3类：模型Ⅰ，通过注射CLD-liposome等试剂抑制人红细胞免疫排斥建立的模型[9]；模型Ⅱ，通过高压注射含有人IL-3和EPO基因质粒促进人红细胞骨髓分化建立的模型[22]；模型Ⅲ，通过反复注射大量人红细胞抵消小鼠吞噬反应建立的模型[27]。

3.1 通过注射CLD-liposome等试剂抑制人红细胞免疫排斥所建立的模型吞噬细胞对人红细胞的排斥是导致人源化小鼠中人红细胞缺陷的最主要原因之一。因此，在造血免疫系统人源化小鼠体内，经尾静脉注射小剂量CLD-liposome即可实现约4%的人红细胞重建[11]。联合应用CLD-liposome和CVF可将外周血人红细胞重建的比例再提高约1倍[18]。中性粒细胞也是一类具有吞噬能力的免疫细胞，CLD-liposome无法清除中性粒细胞，因此研究者通过注射抗中性粒细胞的抗体来阻断中性粒细胞的吞噬作用[10]，联合CLD-liposome也可以提高外周血中人红细胞的重建。另外，在CLD-liposome处理小鼠体内注射人细胞因子IL-3和EPO能实现较高水平的人红细胞重建(约25%)[22]。该模型优势在于由人造血干细胞发育而来的人红细胞能更好地模拟红细胞的正常生理状态，且人免疫系统与红细胞为同一供者来源。

3.2 通过高压注射含有人IL-3和EPO基因质粒所建立的模型红细胞分化发育所需细胞因子信号缺失或不足是人源化小鼠中人红细胞发育效率低的原因之一[22]。直接注射可溶性细胞因子IL-3和EPO有利于人红细胞的生成，但需多次给药，操作较为复杂。因此可通过构建含有人IL-3和(或)EPO基因的表达质粒[22]，利用高压注射的手段将其注入人源化小鼠体内，使小鼠细胞大量表达并分泌该细胞因子，以供人红细胞分化发育所用[22]。但是，由于单独高压注射IL-3/EPO质粒并未克服小鼠吞噬细胞对人红细胞的强烈排斥作用，人源化小鼠中人红细胞的重建水平较低(1%～4%)[10]。

3.3 通过输注过量人红细胞抵消小鼠吞噬反应所建立的模型该方法需要频繁输注人红细胞来维持小鼠体内红细胞水平，多用于疟疾感染模型[28]。该模型的缺点是其外周血中人红细胞来源于回输入小鼠体内的成熟人红细胞而不是由小鼠骨髓中的人造血干细胞分化而来，因此无法用于研究人红细胞的分化发育过程以及相关疾病(如遗传导致的贫血)；另外，该方法操作较为复杂，需要每天注射大量人红细胞以维持人红细胞水平[27]。

4 具有人红细胞组成的人源化小鼠模型的应用

红细胞是血液中的主要成分，主要负责氧气运输。据估计，成年人每秒能产生240 000个新生红细胞。而如此大量的人红细胞更新主要依赖于极少量定居于骨髓的造血干细胞通过红细胞造血(erythropoiesis)过程实现[29]。该过程中微小的基因异常均可能导致严重的血液系统疾病，例如β-地中海贫血和镰刀状红细胞贫血等，目前除了异体骨髓移植外并无有效的根治方法[30]，而异体骨髓移植会带来严重的不良反应，如移植物抗宿主疾病(GVHD)。近年来，以胚胎干细胞和诱导干细胞为代表的干细胞技术取得了突飞猛进的发展。2008年Lu等[31]利用胚胎干细胞在体外分化出无核成熟的红细胞；2017年Sugimura等[32]将人多能干细胞分化成人造血干细胞，其能够在人源化小鼠体内分化成脱核的人红细胞。另一方面，以CRISPER-Cas9技术为代表的基因编辑技术也使通过基因编辑根治遗传性贫血成为可能[33]。具有人红细胞重建的人源化小鼠模型为上述技术的开发和临床转化应用提供了理想的研究和检验平台[11]。

人红细胞可成为某些病原微生物(如疟原虫)的侵袭对象[34]。迄今为止，针对疟疾的有效疫苗仍然未研制成功[35]。由于疟原虫感染具有宿主特异性的特点，传统实验动物无法模拟人类疟原虫感染。目前研究疟疾多选用感染啮齿类动物的疟原虫感染小鼠或大鼠，间接研究人类疟疾感染机制及治疗策略，无法准确反映疟疾患者的实际情况[36]。Chen等[27]研究疟疾感染过程结果显示：人NK细胞优先与被感染的红细胞相互作用，从而清除被感染的红细胞。该模型的缺点是人红细胞为异体来源，且需要反复、大量注射，小鼠巨噬细胞会不断吞噬输入的人红细胞(包括被疟疾感染过的人红细胞)，与人体内情况也不相同。因此，建立具有稳定、高水平人红细胞重建的造血免疫系统人源化小鼠模型对人疟疾感染的机制研究和新药开发具有重要意义。

5 展 望

具有人红细胞重建的人源化小鼠模型的开发对于人红细胞相关疾病的研究具有重要意义，但其发展长期远远落后于具有免疫系统重建的人源化小鼠模型[7]。经过近些年的研究，已逐渐明确了人源化小鼠中人红细胞缺陷的原因，初步实现了成熟人红细胞在人源化小鼠模型中的重建[9,18]。然而，上述模型并未得到广泛应用，主要原因是小鼠巨噬细胞以补体C3非依赖方式排斥人红细胞的机制仍不清楚，而克服小鼠巨噬细胞排斥所需注射的CLD-liposome对免疫缺陷小鼠具有较大毒性。因此，进一步明确免疫缺陷小鼠巨噬细胞排斥人红细胞的机制、有针对性地阻断该排斥作用是建立具有长期、稳定水平人红细胞重建的人源化小鼠模型的关键。随着人红细胞排斥机制研究的深入和特异性抑制人红细胞排斥方法的出现，红细胞人源化小鼠模型将被更多地应用于人红细胞相关疾病的研究中，促进人红细胞相关新型疗法的转化应用。