以BRAFV600E为主的分子标志物 联合检测对甲状腺乳头状癌预后评估的应用价值

李 婕，祝寒宇，余泽伟，许佩蓉，饶舜禹，金 欣

(绍兴文理学院 医学院，浙江 绍兴 312000)

甲状腺乳头状癌(papillary thyroid carcinoma，PTC)是最常见的内分泌恶性肿瘤，近年来全球发病率迅速升高。一般认为PTC是一种惰性肿瘤，具有较高的治愈率和良好的预后，然而有15%～20%的患者仍然有复发或伴有转移的进行性疾病过程[1]。考虑到疾病预后的异质性，是积极治疗肿瘤以预防疾病复发，还是保守治疗以减少相关并发症风险，临床上仍存争议[2]。问题的焦点集中在如何更准确地识别最可能具有不良预后的患者。建立更加精确的风险分层是解决问题的关键，进一步探明PTC的分子发病机制、筛选高效的PTC预后分子标志物是目前研究的重点。

BRAFV600E突变位于人染色体7q34，通过异常激活促分裂素原活化蛋白激酶 (mitogen-activated pro-teinkinases，MAPK)信号通路，在包括甲状腺癌在内的许多肿瘤的发生发展中起重要作用。BRAFV600E突变与PTC较差的临床后果具有较强的相关性[3]，但尚不能作为PTC患者预后评价的独立指标[4]。研究发现，分子标志物的联合检测有利于改善PTC复发风险分层，为PTC的治疗及预后判断提供更为可靠的依据[5]。本文就BRAFV600E联合端粒酶反转录酶(telomerase reverse transcriptase, TERT)、微小RNA(microRNA，miRNA)及P53等分子标志物检测的最新相关研究进展进行综述。

1 与TERT启动子突变的联合检测

人体内的端粒酶可维持端粒重复序列长度，从而拮抗癌细胞高增殖率诱发的复制性衰老和凋亡，其功能异常是许多肿瘤的共同特征。端粒酶活性主要取决于TERT的表达水平，目前已在甲状腺癌、黑色素瘤和膀胱癌等肿瘤中发现两种常见的TERT启动子突变，分别发生于-124 bp(chr5：1 295 228 G>A，以下称为C228T)和-146 bp(chr5：1 295 250 G>A，以下称为C250T)。在大多数肿瘤中C228T突变比C250T突变更常见，这两个TERT启动子突变以互相排斥的方式发生，均能产生E-26(ETS)转录因子的结合位点，增加TERT启动子的转录活性[6]。

甲状腺癌中的TERT启动子突变常见于侵袭性甲状腺癌和BRAF突变阳性的PTC。与BRAFV600E突变不同，TERT启动子突变与PTC侵袭性临床病理特征和长期预后不良的关联性已非常明确[7]，作为新型预后标志物受到相当大的关注。BRAFV600E和TERT启动子突变在PTC中的联合检测研究首次报道于2014年[8]，通过对中国PTC患者的队列研究初步验证了两种突变共存与PTC侵袭性生长的相关性，初步揭示了该项应用的临床前景。在对PTC患者的突变发生率检测中[9]，有11.4%的BRAFV600E突变患者伴TERT启动子突变(中位数12.9%；范围4.8%～34.4%)，无BRAFV600E突变者中TERT启动子突变发生率为6.3%(中位数5.4%；范围0.9%～14.3%)，可见在PTC中两种突变可能存在密切联系。伴双突变的PTC患者观察到比伴BRAFV600E和TERT启动子单独突变的PTC患者具有更高风险的临床病理特征，包括高TNM分期、甲状腺外侵袭、淋巴结转移及远处转移等，表明了其可作为PTC有希望的诊断及预后遗传标记[6]。通过临床1 051例PTC样本检测发现，BRAFV600E和TERT启动子共突变与PTC患者病死率的相关性远远超出任一单独突变或传统临床病理特征，证实了其在PTC侵袭性发展中的重要作用及两种突变共存的强大协同效应[10]。由此可见，共存的BRAFV600E和TERT启动子突变在PTC中形成了一种新的遗传背景，可作为PTC潜在的特殊侵袭性发病机制，关于两者的联合检测将可能有助于临床上PTC的复发风险分层和预后评估。

解释BRAFV600E和TERT启动子突变协同效应的一个主要的潜在分子机制是BRAFV600E/ MAP激酶途径磷酸化并激活FOS，FOS反过来充当转录因子来结合并激活GABPB启动子，增加GABPB表达及驱动GABPA-GABPB复合物的形成，后者选择性结合ETS转录因子，激活突变的TERT启动子最终实现TERT的过度表达，从而促进癌细胞的侵袭行为和肿瘤发展[11]。除此之外，BRAFV600E/ MAP激酶途径也可以通过MYC以TERT启动子突变非依赖性的方式上调TERT表达。在黑色素瘤中也观察到TERT启动子突变与BRAFV600E突变之间存在关联，提示这两种致癌基因事件之间的协同效应可能是人类肿瘤的普遍现象[12]。由于大多数研究受限于样本量及TERT启动子突变的低发生率，且缺乏有关TERT启动子突变和BRAFV600E突变状态的详细数据，因此目前仍需要对大量具有特征性BRAFV600E和TERT启动子突变的PTC患者进行长期随访的前瞻性随机研究，以验证TERT启动子和BRAFV600E突变的协同作用在评估PTC患者预后中的应用价值。

2 与miRNAs表达的联合检测

miRNAs是一类长度为19～25个核苷酸的内源性非编码RNA，通过与靶mRNA的3′非翻译区结合，导致靶mRNAs降解或翻译阻断而发挥基因表达的负调节功能，其功能异常可促进恶性肿瘤的发生发展。miRNA在PTC中的表达谱与PTC的组织学类型和复发风险相关，且与在其他肿瘤中观察到的现象相反，在PTC中异常表达的miRNA主要呈现表达上调，包括miR-146b、miR-221和miR-222等[13]。尤其是近年来备受关注的miR-146b，已被证实其与PTC高风险临床病理因素特征相关，具有独立的预后价值[14]。miRNA在各种人类生物样本中显示出良好的稳定性，包括细胞系、新鲜冷冻或经石蜡包埋的组织、甲状腺细针穿刺活检(fine-needle aspiration，FNA)组织、血浆、血清和尿液等[15]，因此miRNA作为PTC新兴分子标志物具有较好的临床应用前景。

将PTC患者分为BRAFV600E突变组和非BRAFV600E突变组，比较miRNA的表达水平发现，在BRAFV600E突变组中，miRNA-221、miR-222和miR-146b表达水平显著高于非BRAFV600E突变组，初步提示了BRAFV600E突变与miRNA表达存在关联[16]。此外，现已观察到miR-7-5p、miR-204-5p、miR-21*和miR-203的表达失调与BRAF阳性PTC中的侵袭性行为也存在一定关联(P<0.05)，表明两者间的相互作用可能是甲状腺癌变过程中的关键事件[17-18]。BRAF/miRNA调控关系的发现为PTC发生发展的生物学研究开启了一个崭新的视角，BRAF癌基因可通过改变涉及miRNA生物合成的基因的表达模式直接或间接影响miRNA表达[19]，其可能的机制是MAPK信号传导途径和AP-1介导了BRAFV600E突变和miRNA异常表达间的联系[18]。另有研究[20]发现14个在PTC中表达下调最明显的miRNA中有12个在BRAFV600E阳性PTC样本中表达下调更显著，且PTC样本亚型之间miRNA表达的变化似乎主要与BRAFV600E突变状态相关。对此进行的进一步探究表明BRAFV600E突变可组成性激活RAS/RAF/MAPK途径，从而促进miRNA的异常表达。

也有少数研究发现，异常表达的miRNA与BRAFV600E突变状态无关[21]，因此仍需进一步阐明miRNA和BRAFV600E突变在PTC发生发展中相互作用的具体机制。此外，研究之间缺乏一致性是miRNA分析研究的共同缺点，包括实验方案的变化、测量平台的差异及研究的样本数量有限等。由此可见，为了提高miRNA表达在临床上的应用效率，需深入研究miRNA的生物功能，例如在各种组织中的表达模式，进一步开发和验证用于检测靶miRNA绝对值的技术。

3 与P53蛋白表达的联合检测

P53基因是迄今发现与人类肿瘤相关度最高的肿瘤抑制基因，其蛋白质产物P53可通过多种途径调控基因转录、细胞周期、DNA修复和细胞凋亡。在甲状腺肿瘤中，P53突变通常发生在未分化(anaplastic thyroid carcinoma，ATC)或低分化甲状腺癌(poorly differentiated thyroid cancer，PDTC)中(ATC占50%～80%)，然而近来发现高达40%的PTC中也存在P53突变。免疫组化分析显示P53蛋白表达稳定，其过表达已被证实与PTC的病理分级、不良预后相关，可作为PTC潜在的预后标志物[22]。

致癌性BRAF突变参与PTC的发生，而肿瘤进展及去分化则涉及到包括P53突变在内的其他信号通路的改变。在BRAFV600E突变诱导的PTC小鼠模型中，发现合并BRAFV600E和P53突变可在体内协作以促使其发展为PDTC和ATC，推测两种突变共存或可介导PTC更具侵袭性的行为[23]。BRAF/miR-3151/P53轴的发现初步提示了其可能的相关机制，miR-3151可通过直接下调靶P53的表达，从而导致细胞增殖活跃，促进肿瘤的发生发展，也进一步提示了BRAF突变与miRNA表达之间的联系密切性[24]。此外，临床研究发现血清P53抗体与BRAFV600E突变的检测结果存在互补性，当两者均为阳性时，与临床肿瘤指标的相关性显著提高，对于PTC复发风险分级、预后评估及治疗决策的制定有一定指导意义，如适当扩大手术范围，以减少淋巴结隐匿癌和术后意外癌的发生[25]。由此可见，BRAFV600E突变联合P53蛋白异常表达检测具有一定的临床应用价值和发展前景。

4 问题与展望

随着PTC发病率全球化的上升，面对中国PTC治疗不足、规范和过度并存的现状，追求早期精准诊断及治疗的呼声日益高涨。目前国内PTC分子检测的发展正处于起步阶段，BRAFV600E联合TERT、miRNAs及P53等分子检测的相关研究已取得一定成果，但不同研究之间样本来源及实验方案的差异导致结论尚未统一，仍需进一步阐明分子联合如BRAF/miRNA调控的具体作用机制。此外，受限于技术、设备及费用等因素，实现多分子联合检测的临床普及还存在一定困难。

然而，分子标志物的联合检测作为新的研究方向有望弥补影像学检查、细针穿刺诊断的不足，辅助PTC复发风险精准分层和预后评估，提供靶点治疗依据，从而优化PTC患者的个体化治疗，具有巨大的应用前景。现关于TERT启动子突变的联合检测研究已相对成熟并初步应用于临床，进一步发掘具有高度特异性和敏感性的miRNAs及深入探究BRAFV600E突变与P53蛋白表达的相互作用可作为未来研究的重点。此外，有报道其他因子如PIK3CA、TgAb等与BRAFV600E突变存在关联，值得后续进一步关注验证。