腺苷A2A受体在中枢神经系统损伤中的相关研究进展

，，，

[1. 陆军军医大学(第三军医大学)野战外科研究所分子生物学中心创伤烧伤及复合伤国家重点实验室，重庆 400038；2.陆军军医大学(第三军医大学)研究生院，重庆 400038]

中枢神经系统(central nervous system,CNS)损伤包括创伤性损伤和非创伤性损伤，非创伤性损伤含义较广。本文专指血管性损伤，包括出血、缺血等。CNS损伤以其高发生率和高死残率，已经成为紧迫的世界性公众健康问题[1]。虽然在这一领域已经有大量的研究，但直至目前，尚缺乏安全有效的治疗方法。因此，探索CNS损伤的治疗方法、靶点是神经科学领域亟待解决的关键问题。腺苷(adenosine)在人体的各个系统广泛分布，包括心血管系统、消化系统、神经系统等，其通过4种腺苷受体(adenosine receptor,AR)亚型，即A1R、A2AR、A2BR和A3R发挥多种不同效应。在CNS损伤后，细胞外腺苷浓度会大幅度升高，引起腺苷受体的活化[2]，以激活A1R及A2AR为主，A2AR虽然表达不如A1R丰富，但在许多病理条件下却发挥更为主导的作用[3]。本文就现有研究现状，针对A2AR在中枢神经损伤中的作用与机制进行综述，以期为A2AR的临床应用提供理论支撑。

1 中枢神经系统的腺苷及A2A受体

1.1 中枢神经系统腺苷及腺苷的生化代谢

腺苷是一种内源性的嘌呤核苷，是嘌呤核苷酸的前体物质与代谢产物，在生理和病理情况下都发挥重要的作用。腺苷一方面来源于胶质细胞或神经末梢释放[4-5]，另一方面来自三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)的代谢。无论细胞内或细胞外的ATP都可以经过二磷酸腺苷(adenosine diphosphate，ADP)、一磷酸腺苷(adenosine monophosphate,AMP)，并通过5’-核苷酸酶催化形成腺苷[6]。

而对于腺苷的代谢，腺苷经腺苷激酶催化形成AMP，AMP再转变为ADP。ADP可经腺苷酸环化酶生成环1-磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)，cAMP再经磷酸二酯酶催化形成AMP。 与此同时，腺苷还可以经腺苷脱氨酶形成肌苷，再经核苷酶形成次黄嘌呤。另外，在细胞内腺苷可以与S-腺苷基高半胱氨酸 (SAH) 相互转化。使用核素示踪技术可以发现，50%的腺苷被细胞摄取，25%降解为肌苷。

生理情况下组织中的腺苷浓度低于1～2 μmol/L，然而在CNS损伤后，腺苷的细胞外浓度急剧升高(100～1 000 μmol/L)[7]，有多种原因可以导致细胞外腺苷的急剧上升。在损伤早期，细胞外腺苷升高的主要原因是由于大量释放到细胞外ATP迅速代谢成腺苷。随后的病理过程中，腺苷主要通过平衡核苷转运体2(equilibrative nucleoside transporter 2，ENT 2)从细胞内释放[8]；与此同时损伤导致的富集核酸转运体2和3(concentrative nucleoside transporters (CNT) 2 and 3)以及平衡核苷转运体1(ENT1)的下调使细胞外核苷的细胞再摄取受到抑制，从而加重了细胞外核苷浓度的上升[9]。

1.2 中枢神经系统腺苷A2AR与其活化后的信号通路

腺苷受体可以分为四种亚型，并且已经被分子克隆，分别是A1R、A2AR、A2BR和A3R。不同的腺苷受体，介导不同的效应。高亲和力的A1R，A2AR，腺苷浓度较低时就可产生作用。而 A2BR 和 A3R 的亲和力较低，一般仅在病理情况下有大量腺苷时才可活化。

A2AR蛋白由410个氨基酸构成，其氨基酸序列在哺乳动物中具有高度同源性。在CNS中，A2AR的脑区分布主要在纹状体、伏隔核、嗅球，同时在海马、皮质、杏仁核及下丘脑等区域也有少量分布；A2AR在多巴胺能神经元、小胶质细胞以及星形胶质细胞均有表达，在炎性细胞(包括淋巴细胞和颗粒细胞等)也有表达。A2AR在突触前和突触后都有表达：突触前主要表达于谷氨酸能、GABA能、胆碱能以及去甲肾上腺素能投射纤维；突触后主要存在于GABA能神经元，并且在这类神经元上有较多的多巴胺D2受体。

A2AR是兴奋性受体，与Gs蛋白偶联，是环磷腺苷(cAMP)-蛋白激酶A(PKA)通路的关键步骤[10]，同时也有文献报道也与Golf 偶联[11]。与其他腺苷受体类似，A2AR与MAPKs通路偶联[12]，而也有文献报道在海马突触小体发现了A2AR可直接激活蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)[13]。此外 ，A2AR还可以与其他受体及信号分子相互作用：例如，能与A1受体、多巴胺D2受体、代谢型谷氨酸受体5亚型(metabotropic glamate 5 receptor，mGlu 5)、N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartic acid，NMDA)受体及大麻素1受体结合形成异源二聚体或相互作用[14]。另外有文献报道，A2AR能结合成纤维细胞生长因子和脑源性神经营养因子(brain derived neurotrophic factor，BDNF)，从而影响突触传递[15]。

2 中枢神经系统损伤中A2AR的作用与机制

目前的研究表明，A2AR阻断剂与激动剂对CNS损伤的效应随病程发展变化。CNS损伤后，细胞外谷氨酸浓度急剧上升，并且这种上升时间在缺血性脑损伤中至少维持4 h，在颅脑创伤中至少维持12 h。细胞外大量谷氨酸引起的兴奋性毒性作用引起了急性组织损伤与炎症级联反应，并且已经证明A2AR受体激活在加剧细胞外谷氨酸浓度上升中起关键作用。在随后的几小时至数天的病理过程中，炎症反应由炎症细胞级联放大，而在免疫细胞上的A2AR受体激活却可以降低免疫细胞在脑实质中的激活、黏附、与血管壁渗透能力[16]。因此，A2AR拮抗剂对早期兴奋性毒性作用起保护作用，而A2AR激动剂在随后的病理过程中稳定炎症细胞，减轻炎症反应起保护作用。

2.1 A2AR拮抗剂对早期继发性损伤的作用与机制

2.1.1 A2AR拮抗剂可以降低损伤后细胞外谷氨酸浓度以及NMDA受体功能

A2AR受体拮抗剂的保护效应主要依赖于对兴奋性毒性反应的控制，全身系统性或局部使用选择性A2AR拮抗剂ZM241385对红藻氨酸盐(kainate)以及联合使用喹啉酸(quinolinic acid)与白介素(IL-1)[17]引起的兴奋性毒性作用都有保护作用。

在纹状体，A2AR主要表达在伽马氨基丁酸-脑啡肽(γ-aminobutyric acid(GABA)-enkephalin)能神经元上，突触前则在谷氨酸能突触末梢上丰富表达[18]，因此A2AR可以直接参与调控谷氨酸的释放[19]。在海马，A2AR也对神经递质的释放起关键调控作用，在氧糖剥夺(oxygen-glucose deprivation,OGD)模型中，选择性拮抗剂ZM241385 与 SCH58261可以在延缓与细胞损伤高度相关的缺氧性去极化(anoxic depolarization，AD)的出现，并且可以减轻神经元与星型胶质细胞的损伤[20]。并且A2AR拮抗剂在海马的保护作用时间窗与使用谷氨酸受体阻断剂相同[21]，提示A2AR受体拮抗剂的作用是通过降低谷氨酸兴奋性毒性实现。

A2AR调控细胞外谷氨酸浓度有多种机制。首先最重要的是A2AR拮抗剂可以通过突触前谷氨酸能神经末梢上的A2AR，从而减少谷氨酸的释放[19]。其次，A2AR能够调控神经元以及胶质细胞上的谷氨酸摄取转运体，诸如星形胶质细胞上表达的A2AR受体激活后可以通过调控Na+/K+-ATPase[22]，进而调控谷氨酸转运体-1(glutamate transporter-1,GLT-1)而降低谷氨酸的再摄取，从而增加细胞外谷氨酸浓度，使用A2AR拮抗剂或敲除A2AR基因可以阻断这一效应。再次，A1R与A2AR存在紧密的互作关系，在海马与皮层的神经突触末梢，A2AR激活可通过PKC通路降低A1R的亲和力从而进一步增加谷氨酸的释放[23]。另外，A2AR受体拮抗剂可以增加GABA的细胞外浓度，从而抑制谷氨酸的释放。选择性A2AR激动剂可以抑制GABA的细胞外释放，并且通过去除PKC介导的 GABA 转运体1(GABA transporter 1,GAT-1)抑制从而增加GABA的再摄取。

A2AR除了可以调控神经递质的传递，还可以直接调控AMPA受体[24]以及NMDA受体[25]功能。在纹状体神经细胞膜，NMDA受体受到D2受体和A2AR形成的异聚体调控[26]。与此同时，mGlu5受体也受A2AR调控，已经有充分的研究证明mGlu5受体能够调控NMDA受体的功能[27]。有研究发现，在OGD模型引起的长时程增强(LTP)过程中， A2AR的激活能够使AMPA受体的表达和募集增加[28]。

2.1.2 A2AR拮抗剂可以抑制损伤后丝裂原活化蛋白激酶 (MAPK)的激活以及c-fos的表达

研究表明，A2AR对转录以及翻译后修饰的相关蛋白有重要的调控作用。在CNS损伤24 h后，几乎所有的丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPK)家族成员的激活水平均显著提高。A2AR拮抗剂可以显著降低小胶质细胞上 P38的磷酸化[29]。研究表明，A2AR的激活可以引起小胶质细胞的激活，而激活的小胶质细胞将分泌细胞毒性因子以及炎症因子，从而启动炎症反应，加重神经损伤。抑制P38的激活在OGD模型中起保护作用，并且使用A2AR拮抗剂可以有效抑制损伤后小胶质细胞的活化以及炎症因子IL-1β的增加[30]，因此A2AR拮抗剂可能通过抑制P38的激活从而抑制小胶质细胞的活化。

另外，A2AR阻断剂可以显著降低少突胶质细胞上JNK的磷酸化水平，而JNK激活磷酸化已经被证实参与了少突胶质细胞死亡，以及髓鞘损伤与错构。并且有研究证明，在损伤后A2AR受体拮抗剂可以通过抑制Oligo2而促进少突前体细胞(OPCs)成熟向少突胶质细胞转化[31]。

与此同时，使用A2AR拮抗剂还能抑制胶质细胞上的c-fos基因表达[32]，而Fos家族产物会促进炎症相关基因的表达。

2.2 A2AR激动剂对继发性炎性反应的作用与机制

神经炎症反应已经被公认为CNS损伤继发性损伤的首要机制[33]。在CNS损伤发生后的数分钟至数小时，细胞外谷氨酸浓度逐渐开始剧烈上升，并激活固有免疫细胞小胶质细胞，使其发生形态改变、增殖、迁移，并分泌炎症因子、细胞因子等[34]。与此同时，增加的促炎因子使细胞黏附分子在血管内皮细胞上表达增加，同时增加血脑屏障(blood-brain barrier, BBB)的通透性，从而增加了白细胞(中心粒细胞、淋巴细胞和单核细胞)在损伤区的侵润[35]。侵润的白细胞以中性粒为主，分泌大量的炎症因子与趋化因子，从而进一步加重了损伤区的炎症级联放大效应。中性粒细胞在损伤的聚集程度，与脑组织损伤的严重程度、神经功能预后密切相关[36]。

A2AR是重要的炎性调控分子，此前诸多外周组织损伤机制及创伤修复研究证实，激活A2AR能显著减轻组织炎性损伤，促进伤口愈合，如减轻急性肺损伤、缺血性肝损伤、肾损伤及增加皮肤创面的愈合与修复。然而在CNS损伤中，既有研究观察到激活A2AR确实得到保护效应，又有实验观察到了截然相反的现象——激活A2AR加重神经损伤，拮抗A2AR反而能获得保护效应。例如，在红藻氨酸引起的脑和脊髓兴奋性毒性损伤模型中均发现，系统性应用A2AR激动剂CGS21680可以引起损伤后神经保护效应而直接局部立体注射却无法起到保护作用。这一现象提示，A2AR激动剂可能不仅仅作用于“脑固有细胞”。目前一种观点认为A2AR激动剂在中枢神经系统损伤中的保护效应的靶点是骨髓来源的细胞(bone marrow-derived cells，BMDCs)，并且A2AR激动剂CGS21680可以显著减少损伤区BMDSs侵润[37]，而在A2AR KO小鼠却发现了更多炎细胞侵润与神经炎症相关因子的表达[38]。更有意思的是，在BMDCs A2AR特异性敲除小鼠全身系统性应用A2AR激动剂没有神经保护效应，而在系统性A2AR敲除鼠移植有A2AR的BMDCs后恢复了神经保护效应[16]。此外，在缺血性脑卒中[33]，脊髓创伤[39]、肠缺血再灌注损伤[40]等损伤中也观察到了A2AR激动剂对继发性炎性损伤起保护作用。

然而本课题组在前期研究中发现，创伤性脑损伤(traumatic brain injury，TBI)后激活A2AR发挥加重损伤还是神经保护作用取决于局部谷氨酸的浓度，即：高浓度谷氨酸条件下激活A2AR加重损伤，低浓度谷氨酸条件下激活A2AR发挥保护作用，其机制是局部高浓度谷氨酸使得激活A2AR由原本抑炎的PKA信号通路向促炎的PKC通路偏转，加重了炎症反应，而BMDCs上的A2AR可能是谷氨酸调控A2AR的主要细胞靶标[41]。

3 中枢神经系统损伤以A2AR为临床干预靶点的难点探讨

在神经系统损伤中A2AR的效应非常复杂，激活A2AR有加重损伤与神经保护的双重作用。因此，腺苷A2AR矛盾效应可能涉及的机制也应当是在以A2AR为干预靶点的临床应用中需要注意的关键问题。

首先，需要进一步研制高亲和力、高选择性的药理学干预手段。A2AR的矛盾效应与传统药理学干预的局限性密切相关，尤其是阻断剂与激动剂的选择特异性。有文献指出，干预 A2AR的药理学手段一般对A1R也有一定作用，特别是高浓度使用时[42-43]。另外，已有研究证实，使用不同的药理学干预策略可以实现与A1R受体形成异构体的突触前A2R和与D2R形成异构体的突触后A2R的选择性干预[44]。

其次，需要进一步研究A2AR在不同细胞类型、不同神经区域的效应与机制。A2AR的矛盾效应与主要效应细胞不同有关。A2AR在多种类型的细胞上表达，不同细胞类型上的A2AR可能有不同的效应，诸如现在血管内皮细胞、血小板、炎细胞上表达的A2AR受体激活后，可有扩血管、抑制炎症反应的效应，从而起到保护效应[45]。另外在神经系统的不同区域，A2AR也会有不同的效应。而不同脑区的A2AR产生不同效应可能与A2AR表达量及偶联的G蛋白并不同有关: 在纹状体中，A2AR高表达，并主要偶联Golf；而在海马、皮层，A2AR低表达，并主要偶联Gs蛋白。另外不同的效应可能与不同信号通路介导有关，在纹状体，A2AR的激活不是通过常规PKA途径，而是通过PKC途径抑制兴奋性递质的释放[46]。

再次，需要进一步研究A2AR在不同损伤程度以及不同发展阶段的效应与机制。损伤的不同发展阶段A2AR效应不同如前述，A2AR阻断剂对早期兴奋性毒性作用起保护作用，而A2AR激动剂在随后的次级炎症反应中有时发挥保护作用。损伤的不同严重程度A2AR效应不同，有文献指出，在损伤的某一程度内，腺苷释放激活突触后膜的A2AR可以与A1受体协同抑制兴奋性递质的毒性作用可产生有效的神经保护。当损伤程度过高，过高浓度的腺苷激活突触前的A2AR，释放大量谷氨酸从而加重损伤，而此时A2AR拮抗剂可以有效抑制兴奋性神经递质的释放从而起神经保护作用[7,46]。

综上，目前A2AR的非选择性拮抗剂已经被广泛应用，诸如生活中常见的茶碱和咖啡因。并且A2AR的三维晶体结构已经在2012年成功解析，进一步促进了A2AR为靶点的化合物设计[13]。 目前以A2AR为靶点的药物在临床实验的有默沙东公司的 preladenant及罗氏公司的tozadenant等。虽然A2ARs非常有潜力，但其在中枢神经系统损伤中作用非常复杂，在不同的组织细胞类型，不同的损伤程度，以及不同的损伤阶段都可能会产生不同的效应。因此如何尽可能利用A2AR拮抗剂的有利作用，并且减少负面效应，从而将其应用于临床治疗中，将是今后研究工作的重点。