中性粒细胞胞外诱捕网与糖尿病足溃疡的研究进展

何秀娟，林 燕，李 萍

(首都医科大学附属北京中医医院 北京市中医研究所，北京 100010)

糖尿病足溃疡(diabetic foot ulcer，DFU)迁延难愈，造成极高的致残和致死率。中性粒细胞是机体固有免疫的第一道防线，通过吞噬、脱颗粒、分泌细胞因子和形成中性粒细胞胞外诱捕网(neutrophil extracellular traps，NETs)发挥防御作用。中性粒细胞活化后形成NETs发挥捕获和消灭病原体作用，这是固有免疫的重要发现。NETs是把双刃剑，参与多种疾病的病理生理过程。新近研究表明，糖尿病激活了中性粒细胞生成NETs，过多或持续存在的NETs导致糖尿病足溃疡创面愈合迟缓[1- 2]。

1 中性粒细胞胞外诱捕网的特征

NETs作为一种不同于细胞凋亡和坏死的死亡方式在1996年被Takei等发现[3]，其形成过程在2004年被命名为NETosis[4]。NETs是中性粒细胞受到刺激活化后释放到胞外的一种DNA网状结构，其间镶嵌有组蛋白、髓过氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)、中性粒细胞弹性蛋白酶(neutrophil elastase，NE)、组织蛋白酶G、钙网蛋白、蛋白酶3、乳铁蛋白、正五聚蛋白3、明胶酶、LL37和肽聚糖结合蛋白等具有杀菌和增加通透性作用的蛋白[5]，这些蛋白镶嵌在DNA骨架上大大增加了其局部浓度[4]。因此NETs的形成被认为是固有免疫的重要事件。目前发现NETosis有3种形式：1)伴随着中性粒细胞死亡的NETosis，被称为自杀性NETosis(suicidal NETosis)，持续2～4 h，也是目前报道最多的模型，但是分子过程并未完全明确[6]；2)核DNA释放的重要NETosis，中性粒细胞形成NETs不破坏核膜和质膜，

时间在5～60 min，并且其不依赖于活性氧(reactive oxygen species, ROS)和Raf/MERK/ERK途径[7]；3)线粒体DNA释放的重要NETosis，GM-CSF和脂多糖刺激后形成并依赖ROS[8]。参与创面修复的NETosis主要是自杀性NETosis[9]，多由PMA诱导，当核膜与胞质颗粒膜融合，NE降解染色质内起连接作用的组蛋白H1，肽酰基精氨酸脱亚胺酶4(peptidylarginine deiminase 4，PAD4)催化核心组蛋白H3或H4的精氨酸进行瓜氨酸化，使染色质解聚，形成DNA 和抗菌蛋白混合物，并随着胞膜破裂，排至细胞外形成网络样结构，此时中性粒细胞死亡[10]。

NETs的形成依赖ROS和NADPH氧化酶[11]。ROS是NE进入细胞核的先决条件。使用蛋白激酶C(protein kinase C, PKC)激活剂(PMA或H2O2)刺激人髓样白血病细胞系PLB- 985后可生成NETs，而刺激缺乏NADPH氧化酶2(NOX2)的X-连锁慢性肉芽肿髓样白血病细胞系PLB- 985(X-CGD PLB- 985)后无NETs生成，但加入H2O2可促其生成少量NETs[12]。Raf-MEK-ERK通路是NADPH氧化酶的上游通路[13]，二酰甘油可以激活PKC，其类似物可以诱导产生NETs，而其类似物又可以被PKC和c-Raf、MEK和ERK的抑制剂所抑制，阻碍活性氧的生成。Raf-MEK-ERK通路可上调抗凋亡蛋白Mcl- 1来抑制中性粒细胞的凋亡而使其发生NETosis。RIPK1-RIPK3-MLKL信号通路在PMA诱导NETs生成ROS的下游发挥作用[14]。使用RIPK1和MLKL抑制剂(NEC- 1和NSA)处理PMA刺激的人中性粒细胞后都未见核膜和质膜破裂，荧光显微镜下发现Nec- 1处理的细胞形成NETs和释放DNA数量减少。同时PMA刺激人中性粒细胞后RIPK3表达和MLKL磷酸化增加。与野生型小鼠相比，RIPK3基因敲除小鼠的中性粒细胞经PMA刺激后NETs数量至少减少50%。但是也有相反的观点认为NETs形成不需要RIPK3-MLKL信号通路参与[15]，两者使用的实验方法类似，但是PMA刺激时间不同，由此说明NETs的研究目前还没有标准化的实验方法和数据分析方法，建立NETs研究的金标准是目前需要解决的问题。

2 中性粒细胞胞外诱捕网与糖尿病

在糖尿病或高血糖状态下，中性粒细胞发生氧化应激并产生白细胞介素6(IL- 6)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等细胞因子，倾向于产生NETs。Ⅱ型糖尿病患者血浆中NETs组分(NE、单-寡核小体和 dsDNA)明显升高，此外，单-寡核小体与糖化血红蛋白(HbA1c)水平呈正相关，血清中IL- 6浓度和dsDNA呈正相关。因此有人提出假说，NETosis失调和高血糖，氧化应激，炎性反应和糖尿病并发症密切相关[16]。此外，如果把非糖尿患者的中性粒细胞放在高葡萄糖(25 mmol/L)条件下培养，和低糖组(5 mmol/L)及甘露糖(25 mmol/L)组相比，更易于产生NETosis。由于无能量的糖不影响NETosis，这个现象可以用糖酵解导致活性氧生成增多来解释。所以NETs在高糖条件生成增多不依赖于糖尿病的类型和来源[7]。

3 中性粒细胞胞外诱捕网与糖尿病足溃疡

糖尿病激活了中性粒细胞发生自杀性NETosis，NETs过多或持续存在导致创面愈合迟缓。NETosis延缓了DFU的创面愈合。DFU患者血液中NETs组分(NE、组蛋白、NGAL及蛋白酶3)和伤口的NE水平明显升高，血清和伤口的NE水平都与感染相关并能预测伤口愈合是否迟缓。DFU患者血液中中性粒细胞发生自发性NETosis增多。糖尿病小鼠创面局部PAD4活性升高，组蛋白瓜氨酸化，活体镜检也发现其切除性伤口床发生NETosis。糖尿病小鼠与正常小鼠相比，其创面瓜氨酸化的H3升高(H3Cit, NET标志之一)，并且创面愈合延迟。因此，Ⅰ型和Ⅱ型糖尿患者及小鼠的中性粒细胞都被激活并产生NETs，PAD4水平升高，从而导致创面愈合迟缓[2]。

NETosis在体内受到双机制的调控，包括脱氧核糖核酸酶1(DNase1) 的消化和巨噬细胞的吞噬作用。巨噬细胞呈表型依赖和时间依赖调控NETosis。巨噬细胞可以吞噬发生NETosis 的中性粒细胞，尤其是M2型巨噬细胞。体外把巨噬细胞和发生NETosis 的中性粒细胞共培养发现，NETs降解后巨噬细胞呈表型依赖性应答，M2型巨噬细胞可分泌MIF，CCL2/MCP- 1，CCL3/MIP- 1a和CCL4/MIP- 1b等促炎因子诱导炎性反应，M1型巨噬细胞在PAD4的作用下释放DNA到细胞外，导致细胞外的DNA增多，这些DNA在半胱天冬酶激活的脱氧核糖核酸酶(caspase-activated DNase，CAD)的作用下被降解并在24 h内被清除。从NETS是把双刃剑的角度看，细胞外DNA 的暂时升高和随后的被清除机制非常合理[17]。最新研究发现糖尿病db/db小鼠创面巨噬细胞由M1型到M2型转化障碍是其愈合迟缓的主要原因之一[18]。糖尿病创面M1型巨噬细胞持续存在导致细胞外的DNA持续增多，如不能及时被清除，会加重组织损伤；M2型细胞减少导致其吞噬发生NETosis 的中性粒细胞能力下降，都导致创面愈合迟缓。

NETs是把双刃剑，除捕杀病原体外也损伤自身组织和细胞。NETs的细胞毒性与组蛋白、NE和MPO密切相关，应用这些蛋白的抑制剂后NETs的细胞毒性明显降低[19]。高浓度的NE降解创面的基质导致愈合迟缓，NETs和组蛋白可直接导致上皮细胞和内皮细胞损伤[20]。这样的毒性环境造成野生型小鼠创面角质细胞增生缓慢。因为正常皮肤不表达PAD4，所以PAD4的异常表达很大程度由于其来源于浸润的中性粒细胞。对于创面修复，使用NETosis来防御微生物可能并不非常有效，比如糖尿病创面经常感染的葡萄球菌属，可通过产生DNase破坏NETs的DNA 骨架来逃避捕杀。

4 药物干预NETs形成和降解治疗糖尿病足溃疡

抑制NETosis或破坏NETs可减轻NETs引起的慢性炎性反应从而促进糖尿病性创面愈合。野生型小鼠切除性皮肤创面产生大量的NETs，而PADi4-/-小鼠(小鼠的PAD4由PADi4基因编码)却没有产生NETs。和野生型小鼠相比，PADi4-/-小鼠创面愈合加快，并不受糖尿病影响。使用PAD4 抑制剂处理可减少小鼠创面结网的中性粒细胞促进伤口愈合[1]。用DNase作用于NETs后，可导致NETs解体并失去抗菌作用。用DNase1处理可促进糖尿病和正常血糖小鼠创面愈合[1]。抑制PAD4来抑制NETs形成或者通过DNase1降解NETs可能成为创面愈合新的治疗靶点。

5 展望

NETs是中性粒细胞功能的重大发现，近十年来，人们对通过NETs 研究发现新的治疗靶点给予了厚望。糖尿病患者的中性粒细胞、炎性反应和组织损伤的相关性已得到初步证实，NETosis和糖代谢的机制还需要深入研究。目前NETosis标志或NETs检测方法的金标准还没有建立，不同实验室发表的实验结果也不完全一致[21]。这些为今后深入研究NETs与糖尿病足溃疡带来了一定难度，但是可以肯定通过调控NETs为糖尿病足溃疡的治疗展现了新的前景和曙光。

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高蛋白饮食无法抵挡糖尿病

据美国WebMD医学新闻网(2016- 10- 15)报道，虽然许多人相信高蛋白饮食有助于减重，但一项新研究发现，实际上它可能阻碍了减重所带来的重要健康益处。

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