我院烧伤科临床分离金黄色葡萄球菌特征及同源性探讨

林时荣 ，宋秋月 ，罗东 ，李培群 ，邹立津 ，陈开森

(南昌大学第一附属医院，1、急诊科；2、南昌大学公共卫生学院；3、检验科；4、烧伤科，南昌 330006)

金黄色葡萄球菌 （Staphylococcus aureus，SA）（简称金葡菌）是医院、社区及畜牧业重要的病原体，常易导致皮肤及软组织感染，由于该菌可产生多种侵袭性酶类、毒力因子及形成耐多药的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 （Methcillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA），故治疗棘手[1-3]。由于该菌易在患者间传播，而采用分子生物学分型方法对临床分离菌株进行同源性分析可有效地监测是否为感染传播导致，从而为流行病学控制提供依据。南昌大学第一附属医院烧伤科为江西省重点学科，为区域性烧伤诊治中心，虽然该病区的金葡菌感染率高，但这些分离菌株的特征、耐药特性及同源关系被了解甚少。本研究将对我院烧伤科2015年分离的临床金葡菌进行回顾性分析，了解菌株的特征及同源性，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 菌株来源 收集2015年1月至2015年12月我院烧伤科分离的非重复金葡菌67株，所有菌株用生物梅里埃公司VITEK-2 compact（法国）仪器鉴定。质控菌株为金黄色葡萄球菌ATCC29213和ATCC43300。

1.2 抗菌药物 青霉素、头孢曲松、头孢西丁、红霉素、林可霉素、四环素、环丙沙星、左氧氟沙星、莫西沙星、利福平、万古霉素、复方新诺明和呋喃妥因为仪器自带，所有药物测定均采用MIC法（梅里埃公司配套的GP67卡）。

1.3 主要试剂与仪器 哥伦比亚琼脂粉购自英国Oxoid公司；革兰阳性鉴定卡（GP卡）及配套药敏卡（GP67）购于生物梅里埃公司；DNA marker、PCR MIX购于上海生物工程有限公司；细菌DNA提取试剂盒购于碧云天生物科技有限公司（江苏海门）。PCR仪购自美国ABI公司；电泳仪购自北京六一公司；凝胶成像系统购自赛默飞时尔公司（美国）。PCR引物由上海生物工程有限公司合成。

1.4 MRSA菌株表型检测 根据2014年CLSI M100S（第24版）准则，筛选MRSA采用的是头孢西丁MIC法，ATCC25923和ATCC43300为阴性和阳性质控菌株。

1.5 DNA模板提取 从纯培养的哥伦比亚血琼脂培养基上挑取过夜培养菌落8-10个到1ml无菌TE缓冲液中，加入20μl的溶菌酶（终浓度20mg/ml），充分混匀离心沉淀，37℃水浴 30min，最后采用CTAB法提取菌株DNA。

1.6 MecA基因筛查 扩增上下游引物，分别为：F：5’-GTGAAGATATACCAAGTGATT-3’；R：5’-ATG CGCTATAGATTGAAAGGAT-3’，产物大小 147bp。反应条件：94℃ 5min；94℃ 30s，58℃ 45s，72℃ 30s共计30个循环，最后延伸7min。扩增产物经2.0%的琼脂糖凝胶电泳确定。

1.7 SCCmec分型 参照文献设计引物[4]。反应条件：94℃预变性 10min；94 变性 30s，65℃退火 45s，72℃延伸 90s共计 30个循环，最后 72℃延伸7min。扩增产物经1.5%的琼脂糖凝胶电泳分析，从而确定MRSA的亚型。

1.8 毒力因子检测 本研究测定的毒力基因包括杀白细胞素（PVL）、耐热核酸酶（Nuc）和血浆凝固酶（Coa）共计3个。引物设计、反应条件等参照文献[5-7]。具体相同Spa X区核苷酸序列的菌株则纯化Nuc PCR产物及Coa PCR产物送上海生物工程有限公司双向测序，产物拼接后采用MegAlign软件分析，观察核苷酸序列是否相同。

1.9 Spa基因检测 PCR扩增Spa基因X区，上、下游引物序列分别为5’-AGACGATCCTTCGGTGAGC-3’ 和 5’-GCTTTTGCAATGTCATTTACTG-3’；反应条件：94℃预变性 5min；94 变性 30s，58℃退火45s，72℃延伸30s共计30个循环，最后72℃延伸5min。扩增产物经2.0%的琼脂糖凝胶电泳确定，阳性结果纯化后送上海生物工程有限公司双向测序，测序结果经双向拼接处理后，与数据库（http：//www.ridom.de/spaserver/)中公布的碱基重复序列比较，从而确定菌株的spa型别。

1.10 Spa X区的同源性 将双向拼接的序列采用Mega5.05软件排列，根据X区5’端和3’的标志性序列进行双向外源序列剪切，剩余序列采用N-J法进行聚类分析，从而了解各菌株间的遗传关系。

1.11 Spa X区的稳定性 随机对5株烧伤科临床分离金葡菌常规条件下培养，每24h传代一次，共计20次。对原代菌及最后一次传代菌的Spa X区PCR扩增（参照步骤1.5和1.9）并测序分析，观察spa X区核苷酸序列的稳定性。

2 结果

2.1 金葡菌分离率 烧伤科2015年共计分离金葡菌72株，除开重复分离菌株，共计分离到67株。其中创面伤口分泌物34株，血流11株，痰及其它12株，根据当年烧伤科标本送检标本总数为2761份，推断出金葡菌检出率为2.61%。

2.2 金葡菌耐药情况 2015年共计分离到67株金葡菌，其中MRSA64株，MSSA3株。67株菌株对青霉素耐药，四环素、红霉素和克林霉素耐药率分别为70.31%、74.63%和62.69%株；庆大霉素和利福平耐药率为59.70%；环丙沙星、左氧氟沙星和莫西沙星耐药率分别为17.91%、14.92%和8.96%。11株菌对复方新诺明及3株菌对喹努普叮/达福普叮耐药，未见万古霉素和利奈唑胺耐药株。

2.3 MecA基因检测结果 67株菌中62株检测到MecA基因，且表型筛查全部为阳性，两者符合率为97.01%。

2.4 SCCmec分型结果 共计62株MecA菌中，Ⅰ型4株；Ⅱ型19株；Ⅲ型27株；Ⅳ型8株；Ⅴ型1株；3株未分出型别。

2.5 毒力因子检测结果 67株菌中，PVL阳性12株，Nuc 67株，Coa 64株，其中MRSA的PVL阳性11株，MSSA的PVL阳性1株。

2.6 Spa分型结果 67株金葡菌共计含有10个基因型，以 t030为主，占总数的 31.34%（21/67）；t062 17株，占总数的25.37%；t002 10株，占总数的14.92%；t127 6株，其中包括t6418 4株；t037 3株；其它少见型别6株。

2.7 核苷酸多态性分析 首先应用Mega5.05软件对67株金葡菌进行序列排列，剪除X区外的前后端测序不完全序列，采用N-J法进行聚类分析，聚类结果见图2。67株菌共分成6个簇，其中簇1至簇 6分别有 29、8、10、2、7及 10株菌。 进一步观察簇别和spa分型结果的关系，发现t030主要在C1、t127在C2、t002在 C3和 t062在C5中。

2.8 5株临床菌株经20d20代传代培养，测序比较前后序列，发现spaX区没有任何SNP改变。

3 讨论

本研究分离的67株菌中，头孢西丁表型筛查检测到64株MRSA，表明烧伤科MRSA检出率高（95.52%，64/67），虽然mecA基因检测是判断菌株是否为MRSA的金标准，然而由于mecA基因存在异质性改变[8]，故通常不能仅以检测到mecA基因来判断是否为MRSA。本研究中，2株MRSA的头孢西丁表型筛查为阳性，但没检测到mecA基因，是否为该原因值得探讨。67株菌全对青霉素耐药，表明所有分离菌株都产生了β-内酰胺酶，红霉素、四环素、林可霉素、庆大霉素和利福平的耐药率接近或超过60%，则这些药物不能常规经验性用于我院烧伤科患者的治疗。三种代表性的氟喹诺酮类药物耐药率都低于20%，，故氟喹诺酮类药可经验性用于治疗金葡菌的感染。复方新诺明和喹努普叮/达福普叮的耐药率低，轻度感染时可考虑。严重性感染时，美国感染性疾病协会（IDSA）推荐使用万古霉素和利奈唑胺治疗[9]。

流行病学调查发现，MRSA亚型Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ共计分离到50株，约占总数的74.6%，表明烧伤科金葡菌感染株主要为医院获得性[10]。另外，本研究中共计9株MRSA菌为Ⅳ或Ⅴ型，且这些株菌都含有PVL基因，而该毒力因子常为社区获得性感染菌株的标识之一，表明烧伤患者存在社区获得性MRSA感染。

Spa测序分型研究发现，该院烧伤病区主要流行株为t030型，这与国内某些研究一致[11]。次要流行株为t062型，该型别菌常引起社区获得性感染，最早于2003年在德国被发现，随后该菌株在法国、比利时等西方国家被发现，近年来，该菌型在发现，例如浙江地区[12]。t002为全球弥散性播散菌株，目前从5大洲都被分离到，占总数的6.9%，本烧伤病区的分离率14.92%，高于全球平均水平。为了进一步了解分离菌株间的遗传关系，我们选择金葡菌A蛋白（spa）基因的X区进行单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphisms，SNP）分析。研究结果表明：该基因区具有较好的位点稳定性，与Frénay等的研究结果[12]一致。此外，部分菌株具有完全相同的序列，故在短时间内认为这些菌株具有流行病学联系。例如6月中旬从烧伤ICU病区2d内分离的3株MRSA和4月初同一病区1株MRSA具有完全相同的X区序列，表明该型菌株导致了烧伤病区的院内感染。虽然有研究认为单采用X区进行重复序列的大小及数目多少的研究的分辨率甚至好于MLST和PFGE分型技术[13，14]。由于不具有流行病学联系的菌株也可有相同的spa分型结果，故对于近期感染传播不能单独依靠spa分型结果来建立。本研究发现，即使具有相同spa型别的菌株由于存在基因碱基的点突变，即spaX区的分型结果相同，但聚类分析所获得的SNP结果不同，这也从具有相同spa分型结果的菌株但并不属于同一簇的结果也证明了这点。我们通过分析spaX区的序列，成功地建立了6组18人的院内感染联系，具有感染联系的患者不旦SCCmec和spa分型结果相同且Nuc和Coa的部分基因测序结果也完全相同，虽然部分患者并不来源于同一病房，是否这些患者是由于中间环节传播而具有感染联系，需要进一步研究。