嵌合抗原受体基因修饰的T细胞免疫治疗骨肉瘤的研究进展

童晨曦， 宋银宏

(三峡大学 医学院 病原与免疫学系, 湖北 宜昌 443002)

骨肉瘤(osteosarcoma, OS)是较常见的发生在青少年或儿童的一种骨恶性肿瘤，在小儿骨恶性肿瘤中最多见，目前骨肉瘤的治疗通常以手术与化疗为主。有资料显示，非转移性骨肉瘤的患者的长期存活率在65%～70%变化；然而，对于转移性患者，其5年存活率则小于20%。转移性病变的快速发展和对化疗的抵抗是导致患者死亡的主要原因，辅助化疗对肺转移患者作用十分有限[1]。这就使得研究新的治疗骨肉瘤的方法显的十分必要。近来一种新兴的免疫治疗方式，嵌合抗原受体基因修饰的T细胞(chimieric antigen receptor-modified T, CAR-T)疗法在一些基础及临床研究中均有报道，现就这方面进行概述。

1　CAR-T细胞免疫疗法

免疫治疗骨肉瘤方面已经展现出了一些治疗效果，过继性T细胞治疗(adoptive cell theapy, ACT)是一种有效的治疗肿瘤的免疫治疗方式[2]。CAR-T作为一种新兴的过继性免疫治疗方法，近年来发展十分迅速， 它并不依赖通常使肿瘤耐受的常规治疗途径，并且在血液肿瘤领域已经得到了成功的应用。其中识别CD19靶点的CAR-T细胞可以治愈B淋巴细胞白血病和淋巴瘤，CTL019也有希望在未来1～2年获得FDA批准上市[3]，这为将CAR-T细胞免疫治疗技术广泛推广到血液肿瘤和实体瘤中带来了希望。嵌合抗原受体(CAR)是由来源于单克隆抗体的细胞外单链可变片段(scFv)、跨膜结构域和胞内结构域组成的合成受体。CAR-T细胞将单克隆抗体的抗原结合特性与T细胞的杀伤效应和自我更新能力相结合，胞内结构域通常衍生自T细胞受体CD3-ζ链，其可与共刺激分子例如CD28或41BB结合[4]。通常将仅含有CD3-ζ链信号传导结构域称为第1代CAR，结合一个共刺激分子称为第2代CAR，结合两个共刺激分子称为第3代CAR[5]。

CAR-T细胞在实体瘤应用中首先要选择合适的靶分子。人表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor- 2, HER2)、白细胞介素11受体α链(interleukin- 11 receptor α-chain, IL- 11Rα)、酪氨酸激酶样孤儿受体1(receptor tyrosine kinase-like orphan receptor 1, ROR1)和神经节苷脂2(ganglioside2, GD2)在骨肉瘤患者肿瘤细胞中表达。因此，这些受体可能作为CAR-T细胞有效的治疗靶点，以免疫治疗骨肉瘤并抑制肿瘤细胞转移[6,10,13,16]。

2　靶向骨肉瘤表面抗原的CAR-T细胞免疫治疗的相关研究

2.1　人表皮生长因子受体2(HER2)

60%的骨肉瘤是HER2阳性，HER2阳性可能与骨肉瘤的不良预后有关。但是HER2基因位点在这种疾病中不扩增，可将HER2靶向免疫治疗扩展到HER2阳性但对HER2抗体不敏感的肿瘤。有研究显示，包含第2代CD28/CD3-ζ胞内结构域的HER2-CAR-T细胞在临床前动物模型中显示出良好的抗肿瘤活性[6]。在犬骨肉瘤实验中也发现，构建的HER2-CAR-T能以抗原依赖的方式识别和杀死HER2阳性的犬骨肉瘤细胞系[7]。但是，CAR-T疗法临床应用的安全性问题仍是需要重视的。一项第2代HER2特异性CAR-T细胞的Ⅰ/Ⅱ期临床研究中，使用的CAR含有衍生自HER2特异性MAb FRP5的胞外域和CD28/CD3-ζ胞内结构域。开始使用超低剂量的HER2-CAR-T细胞(1×104/m2)作为单一试剂，不使用IL- 2或细胞化疗；然后逐渐增加HER2-CAR-T细胞的剂量，最高的细胞剂量达1×108/m2。发现高剂量的 HER2-CAR-T细胞的输注是良好耐受的。这些细胞以剂量依赖的方式运输到肿瘤部位并以低水平持续表达6周以上[8]。在多种细胞毒性药物化疗后，在患者外周血输注HER2-CAR-T细胞是可行的；并且，用于患有HER2阳性骨肉瘤患者的HER2-CAR-T细胞的安全剂量高达1×108/m2。虽然没有发现HER2-CAR-T细胞扩增的证据，但HER2-CAR-T细胞的确在一些患者体内长时间存在。这些输注产物的持久性也决定着CAR-T细胞治疗肿瘤及肿瘤转移的有效性[9]。HER2特异性的CAR-T细胞在临床研究中展现出了归巢、一定限度的持久性和抗肿瘤的效果。改善构建后T细胞的扩增和持久性，会使CAR-T细胞在临床应用中有更好的治疗效果。但某些因素，如：输注给患者的CAR-T细胞剂量的多少；是否同时使用化疗药物和所使用的化疗药物的种类不同；是否输注了IL- 2；不同种CAR的HER2特异性scFv衍生自不同的单克隆抗体，其结合表位不同等，可能使治疗结果有差异。

2.2　白细胞介素11受体α链(IL- 11Rα)

IL- 11Rα是一个有前景的治疗靶点，可应用于治疗骨肉瘤。相比于HER2而言，IL- 11Rα可能是一种治疗或抑制骨肉瘤肺转移更好的靶点。因为转移性结节的生物学特征与原发性肿瘤的生物学特征不同，而在骨肉瘤细胞肺转移中HER2表达较弱，IL- 11Rα高度表达。靶向HER2构建特异性的CAR-T治疗骨肉瘤肺转移可能效果并不佳。除消化道以外，IL- 11Rα在正常器官组织中不表达或者表达很低。但是，在骨肉瘤肺转移中过表达，是骨肉瘤肺转移的功能靶标[10]。用IL- 11肽来构建IL- 11Rα-CAR，使用的肽结合IL- 11Rα作为细胞外受体识别信号，通过嵌合CD28共刺激结构域和激活T细胞的CD3-ζ激活结构域，介导细胞内信号传导；胞内双结构域CD28和CD3-ζ的第2代CAR改善了T细胞活化[11]。IL- 11Rα-CAR-T细胞在体外细胞实验中能靶向杀死4个骨肉瘤细胞系，细胞毒性与IL- 11Rα在肿瘤细胞上的表达水平相关。静脉注射IL- 11Rα-CAR-T细胞治疗确定有骨肉瘤肺转移的小鼠，导致了肿瘤细胞凋亡和肿瘤明显消退，并且没有明显的毒副作用[11]。但能否成功应用到骨肉瘤患者还需要更多的临床研究。前面提到HER2-CAR-T在Ⅰ/Ⅱ期临床研究中的有效性，对相同细胞，用IL- 11Rα和HER2-CAR构建双特异性T细胞可能对治疗是有益处的。最近关于神经胶质瘤的细胞和动物实验中，构建的一种双特异性CAR-T，其并联HER2和IL13Rα2的2个抗原识别结构域，被称为TanCAR-T。TanCAR-T细胞明显表现出比单一特异性CAR-T细胞更强的抗肿瘤活性[12]。但由于IL- 11Rα不是100%表达在每一个骨肉瘤细胞上，这需要有更多的研究来查明HER2是否在IL- 11Rα-OS细胞中表达，以及HER2定向的T细胞的识别和杀伤肿瘤细胞能力。

2.3　酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)

ROR1在包括尤文肉瘤、骨肉瘤、横纹肌肉瘤和纤维肉瘤的肉瘤细胞系中高度表达，而且其在正常成人组织中的表达有限。增加亲和力的ROR1-CAR-T细胞对骨肉瘤模型小鼠具有显著的抗肿瘤功效[13]。用猕猴构建的骨肉瘤灵长类动物模型，研究了B细胞前体、脂肪细胞、胰腺和肺中低水平的ROR1表达是否会导致毒性反应或影响ROR1-CAR-T细胞的存活与功能。结果证明，ROR1-CAR-T细胞在灵长类动物中是安全的，构建的CAR-T细胞同样有抗肿瘤效果[14]。应用到临床还需进一步了解ROR1在正常组织的具体表达和预防靶向的毒性等问题。有几种可以减少CAR-T细胞靶毒性的策略在小鼠模型已经被证明有效，包括自杀基因的共表达；使用mRNA转染T细胞，限制CAR只在转染的T细胞中表达来减少毒性反应；以及包括基于PD- 1和CTLA- 4的抑制性CAR(iCARs)的策略[15]。目前虽不明确这些方法在临床CAR-T治疗已经出现毒性反应的患者时能否发挥作用，但可以在治疗可能出现毒性反应的患者时，预防性地构建这些减少毒性反应的策略。

2.4　神经节苷脂2(ganglioside2, GD2)

GD2是骨肉瘤的CAR-T免疫治疗又一个有前景的靶点。GD2在儿童和成人多种实体瘤中过表达，包括神经母细胞瘤、神经胶质瘤、成视网膜细胞瘤、横纹肌肉瘤、平滑肌肉瘤、脂肪肉瘤、纤维肉瘤、小细胞肺癌、黑色素瘤和骨肉瘤中过表达。在干细胞、神经元、一些神经纤维和皮肤的基底层中也发现存在GD2[16]。骨肉瘤小鼠模型中使用含有14g2a-scFv与CD28、OX40和CD3ζ信号结构域的第3代GD2-CAR加全反式维甲酸(ATRA)的联合治疗显着提高抗肿瘤效果[17]。这种联合治疗方式在其他靶点构建的CAR-T细胞也可以进行尝试。但要应用到临床，还需研究清楚因为GD2广泛的表达，在靶向治疗时可能引起的不良反应以及构建的T细胞在体内有无广泛的杀伤作用等问题。

将多种治疗方法联合应用到骨肉瘤患者可能取得更好的治疗效果。免疫治疗方法和常规治疗方法相结合是一种治疗骨肉瘤的思路；多种免疫治疗方法的联合也有可能增强单一免疫治疗的效果。如CAR-T细胞和一种或者多种用于免疫治疗的免疫检查点抑制抗体联合使用。目前有Ⅰ期临床实验测试单独的PD- 1抗体或与CTLA- 4抗体的组合用于治疗患有骨肉瘤和其他实体瘤的儿童、青少年和年轻成人的安全性和功效。使用PD- 1和/或CTLA- 4抗体与CAR-T细胞组合用于骨肉瘤的免疫治疗的临床试验也可能在近期进行[18- 19]。

3　存在问题及展望

相比于传统过继性T细胞治疗，CAR-T 细胞的scFv结构域直接结合靶细胞表位，并且不需要MHC的抗原呈递。因此，CAR-T细胞可以克服由于HLA下调而导致的肿瘤逃逸[20]。CAR-T细胞识别抗原也更加广谱，不需要繁琐的分离程序，且可以在体内长久存在，持续杀伤肿瘤细胞。这些都是传统的免疫疗法无法达到的。但是CAR-T细胞在实体瘤上的应用也存在着一些挑战。例如，CAR-T细胞治疗会产生不良反应。原因之一在于T细胞活化杀伤过程中释放大量细胞因子，严重时需要白细胞介素6(IL- 6)中和抗体tocilizumb来降低不良反应；CAR-T细胞治疗实体瘤时，更应该注意脱靶效应造成患者正常组织的损伤。研究如何避免这些因素的影响将会给免疫治疗骨肉瘤带来新的启示。如何明确骨肉瘤靶点，使CAR-T细胞具有特异性杀伤能力，准确靶向肿瘤细胞；如何使CAR-T细胞在体内扩增，持续产生效应等都是临床应用CAR-T细胞免疫治疗骨肉瘤所不能忽视的问题。

免疫治疗肿瘤近年来已经取得了长足的发展，但是还没有达到对肿瘤治疗起决定性的作用。骨肉瘤仍然是难以治愈的恶性肿瘤之一，攻克这一问题依然充满着挑战。但是有这么多基础和临床研究已经证明了CAR-T细胞免疫治疗对骨肉瘤具有较好的杀伤作用，坚信随着免疫治疗手段的进一步发展，解决好临床应用中的不足，CAR-T细胞免疫疗法将对治疗骨肉瘤作出突出贡献。