布鲁氏菌感染的固有免疫机制研究进展

王 敏，刘 鑫

(内蒙古民族大学 医学院 病原生物学与免疫学教研室， 内蒙古 通辽 028041)

布鲁菌属(Brucella)是布鲁氏菌病(一类人畜共患传染病)的病原菌，有10个生物种[1]。本属使人致病的有羊布鲁菌(B.melitensis)、 牛布鲁菌(B.abortus)、猪布鲁菌(B.suis)和犬布鲁菌(B.canis)，在中国流行的主要是羊布鲁氏菌病，其次是牛布鲁氏菌病。近年疫情发展迅速，仅2014年就报告57 222例，覆盖中国所有省份[ 2]，对其预防和控制迫在眉睫。本文就国内外对固有免疫系统抗布鲁氏菌感染的实验和临床研究新进展进行综述。以期对临床诊治和疫苗研制方面提供参考。

布鲁氏菌是革兰阴性兼性胞内菌，可感染多种类型细胞并在细胞内繁殖，如巨噬细胞、树突状细胞(dendritic cell, DC)和非吞噬细胞。机体感染布鲁菌后，以细胞免疫为主，病后机体产生的IgG 和IgM类抗体，可发挥免疫调理作用。并在布鲁氏菌各种和生物型之间可出现交叉免疫。

固有免疫系统(innate immune system)被认为是抵御入侵病原体的第一道防线，通过固有免疫监视系统检测组织中细菌的存在。固有免疫系统主要由专职吞噬细胞中性粒细胞和巨噬细胞、DC和自然杀伤(nature killer,NK)细胞组成，通过模式识别受体(pattern recognition receptors, PRRs)识别病原相关模式分子(pathogen associated molecular patterns,PAMPs)[3]， 伴有细胞因子和趋化因子的分泌，并活化补体系统发挥抗感染作用。而布鲁氏菌一方面表面分子缺乏典型PAMPs活性，因此，固有免疫诱导效果很弱；另一方面，布鲁氏菌对固有免疫机制具有调制作用，其主要途径是抑制Toll样受体(Toll like receptor,TLR)、补体系统和吞噬细胞的作用[4]。

1 单核/巨噬细胞对布鲁氏菌感染的应答特点

1.1 布鲁氏菌抑制细胞表面MHC-Ⅰ和Ⅱ分子表达

单核/巨噬细胞是重要的专职抗原提呈细胞，其表面MHC-Ⅰ或MHC-Ⅱ分子的表达影响T细胞对菌体抗原的识别与活化。牛布鲁氏菌(B.abortus)能够诱导CD8+T细胞应答。但是，细菌仍能够在宿主体内长期存在。研究发现，牛布鲁菌介导MHC-Ⅰ类分子滞留在高尔基体内，进而抑制干扰素γ诱导MHC在人类单核细胞表面的表达，且抑制能力依赖细菌活性，并通过表皮生长因子受体和细胞外信号调节激酶(EGFR-ERK)信号通路来逃避免疫系统防御，促进慢性感染过程的发展[5]。牛布鲁氏菌亦可抑制IFN-γ诱导的人类单核细胞表面MHC-Ⅱ 分子的表达，进而减少抗原的提呈，建立胞内寄生并通过不同机制逃避CD4+T细胞介导的免疫应答。细菌不仅能够减少单核细胞表面成熟MHC-Ⅱ类分子表达，也抑制恒定链(Ⅰa)的表达。细菌外膜蛋白19(omp19)可减少MHC-Ⅱ和反式作用子(CIITA)转录。此外，细菌及其脂蛋白通过刺激IL-6的分泌，诱导γ干扰素信号负调控MHC- Ⅱ基因转录，抑制细胞因子信号SOCS- 1和3，阻止T细胞的识别，有利于细菌在机体建立慢性感染状态[6]。

1.2 布鲁氏菌PAMPs对单核/巨噬细胞PRR的作用

巨噬细胞表面具有多种PRRs。主要包括甘露糖受体、清道夫受体和TLR等，介导对病原体的吞噬作用。布鲁氏菌PAMPs(DNA、脂多糖和脂蛋白等)促进PRRs的激活，是有效清除布鲁氏菌的重要步骤[7]。布鲁氏菌DNA中基因外重复回文序列(repetitive extragenic palindrome squence,REPs)能够通过TLR9刺激巨噬细胞，启动TLR9/NF-κB TLR9/MAPK信号通路促进IFN-α的合成。通过体外培养的小鼠RAW264.7单核巨噬细胞株以及Wistar大鼠巨噬细胞均检测到REPs诱导干扰素的合成，当用siRNA敲除巨噬细胞REPs，刺激TLR9后，IFN-γ合成减少[8]。在布氏杆菌病神经功能损害研究中发现，当把小胶质细胞(定居类巨噬细胞)和感染牛布鲁氏菌神经元共同培养可出现明显的神经元死亡消失现象。神经元死亡并非细胞凋亡，而是依赖于小胶质细胞释放一氧化氮(NO)，诱导的神经元暴露PAMP—磷脂酰丝氨酸(PS，即“吃我”信号)。细菌感染刺激小胶质细胞的增殖、吞噬活性增强并通过信号识别吞噬神经细胞，这种现象依赖LPS对TLR2激活[9]。对PRR家族中NOD样受体(nod like receptor,NLR)在布鲁氏菌固有免疫应答中的作用机制研究，发现NOD样受体蛋白12(nod like receptor protein 12,NLRP12)可改变被感染巨噬细胞内caspase-1活化和IL- 1β的分泌，NLRP12基因敲除小鼠感染后肝脏内肉芽肿的数量和体积减小，IFN-γ 和IL- 1β合成增强，NLRP12在布鲁氏菌感染过程中负向调节机体早期炎症应答中发挥重要作用[10]。最新研究发现,血小板活化因子受体(platelet-activating factor receptor，PAFR)是吞噬细胞对牛布鲁氏菌吞噬机制的新型相关受体[11]，被感染巨噬细胞亦可诱导血小板活化因子(platelet-activating factor，PAF)的分泌，PAF 对PAFR刺激可诱导Janus激酶2(JAK2)和p38α磷酸化，显著增加巨噬细胞摄取细菌。

2 树突状细胞(DC)对布鲁氏菌感染的应答特点

2.1 布鲁氏菌抑制DC细胞的抗原提呈功能

DC是功能最强的抗原加工提呈细胞，是连接固有免疫和适应性免疫的桥梁。DC表达多种PRR以及抗体Fc受体，可识别多种PAMP或抗原-抗体复合物(immune complex,IC)，通过胞饮、吞噬和/或受体介导的内吞作用，摄取抗原物质并清除之，执行固有免疫应答。2005年，首次阐明布鲁氏菌可以侵入并在DC内繁殖。已经发现，布鲁氏菌不仅在人类DC还可以在牛和鼠类的DC内繁殖。布鲁氏菌可通过PI3激酶和TLR4受体进入DCs，进而在体内或体外的DC内有效地繁殖，并通过干扰素应答路径影响人类单核细胞来源的DCs的成熟[12]，抑制抗原提呈，导致初始T细胞的活化受阻；同时，被感染DC表面MHC-Ⅱ、CD80 和CD86分子表达下降，进而影响适应性免疫应答诱导进程。

2.2 布鲁氏菌PAMPs对DC细胞PRR的作用

用纯化的牛布鲁氏菌RNA 刺激并培养小鼠DC，上清液中通过ELISA检测到大量IL- 12、IL- 6和γ-干扰素诱导蛋白10；进一步证明，IL- 12分泌依赖TLR7，而IL- 6的分泌依赖TLR7和部分依赖TLR3。而用牛布鲁氏菌感染刺激方法发现，TLR7在诱导DCs分泌IL- 12发挥主要作用，从而认为，牛布鲁氏菌RNA是一种重要的免疫调节核酸，其通过启动TLR7和TLR3信号路径影响鼠类DCs的细胞因子应答和 Ⅰ 型 IFN的表达，进而发挥重要调节作用[13]。而用种属特异性模型(田鼠种布鲁菌，该菌对小鼠有高致病性)，通过野生型和TLR基因(TLR2、TLR4、TLR9单基因和复合基因)敲除型田鼠复制感染模型，对DCs的成熟与促炎性细胞因子分泌进行分析发现，Tc细胞(来自TLR2×4-和4×TLR2×9-/-小鼠)抑制巨噬细胞内细菌繁殖能力降低。提示，TLR2和TLR4参与特异性Tc细胞的生成。认为TLR2 和TLR4是通过影响DCs的成熟和特异性CD8+Tc细胞生成，调控抗田鼠布鲁菌感染[14]。

3 中性粒细胞对布鲁氏菌感染的应答特点

布鲁氏菌是一种可以隐蔽入侵固有免疫系统的病原体，很少激活中性粒细胞，却能够抵抗这些吞噬细胞的杀伤机制。临床观察发现，布病患者靶器官中感染布鲁氏菌的多形核细胞(polymorphoonuclear cells， PMNs)数量较少，患者血液中中性粒细胞呈现占比低的特点。LPS对中性粒细胞功能具有抑制作用。一旦牛布鲁氏被中性粒细胞吞噬，LPS从含有病原菌的囊泡内释放出来后，可触发一种新型非炎性细胞死亡，防止内吞细菌被杀伤，并伴有低剂量促炎细胞因子CD14分泌，通过阻断CD14分泌而不阻断TLR4，可以阻止布鲁氏菌LPS诱导的PMNs过早死亡[15]。

4 NK细胞对布鲁氏菌感染的应答特点

布鲁氏菌通过诱导抗原加工提呈细胞释放IL- 2活化NK细胞，活化后NK细胞具有杀伤功能，同时分泌IFN-γ；IFN-γ在启动Th1 和 Tc1样应答中起着重要的作用。布鲁氏菌感染过程中的一个突出特点是多克隆抗体的快速产生，特别是IgG2c亚类的产生。多克隆抗体产生过程中，B细胞的活化除了对克隆特异性抗原的特异性识别，还需要NK细胞的辅助(直接和细胞因子的放大作用)，NK细胞去除后，可显著降低这些抗体的生成[16]。

5 其他固有免疫细胞应答及细胞因子分泌特点

人类CD4+iNKT细胞(invariant NKT)具有抗猪布鲁氏菌活性[17]，可以直接参与细菌清除，还通过杀伤侵染的巨噬细胞进而控制猪布鲁氏菌的胞内繁殖生长。其主要机制是iNKT细胞与巨噬细胞表面CD1d分子的相互作用，诱导Fas途径和裂解颗粒的释放，发挥细胞毒作用。

辅助性T细胞(Th)1型/2型细胞因子之间的平衡决定对布鲁氏菌有抗性还是易感。通过分析细胞因子水平，可评估免疫系统在布鲁氏菌感染及愈后中的作用。对急性期布鲁氏菌病患者治疗前后血清两种细胞因子TGF-β和IL- 17，含量变化进行测定分析，结果，与健康对照组相比，患者血清中TGF-β含量显著性降低，治疗后期血清含量升高；而患者血清IL- 17 含量显著性升高，治疗后下降；但是，患者组两种细胞因子治疗前后变化统计学显示无显著性差异[18]。

6 结语与展望

布鲁氏菌可多途径感染机体，通过典型的胞内寄生以隐秘的方式逃避或抑制固有免疫[19]，或通过诱变方式(指病原体通过改变自身的抗原特性)调节适应性免疫，建立慢性、持续性感染。在感染的初期或急性期，机体能否及时控制布鲁氏菌的复制，成功消灭其感染，固有免疫系统是关键所在[20]。目前，对于布鲁氏菌的固有免疫研究多集中于对其主要寄生细胞，即巨噬细胞和DC的研究。这两类细胞表面PRR的识别作用和DC亚群特异性应答特点已成为近年的研究热点。一些研究结果对于对布氏菌致病和免疫检测具有积极意义，如筛选具有活化TLR9的牛种布氏菌REPs，并检测其活性；采用乳脂肪球表皮生长因子8 蛋白(milk fat globule epidermal growth factor 8，MFG-E8)或其受体，可抑制小胶质细胞的吞噬作用而不影响其活化，防止神经元消失，为未来在治疗布鲁氏菌感染对神经系统损害提供了一个新思路。另一方面，目前研究结果具有局限性，如多数数据来源于实验动物，不同动物之间存在差异；实验采用菌株多为牛种布鲁氏菌，不能全面揭示其他常见流行菌种诱导易感动物或人类机体固有免疫的特征。因此，对布鲁氏菌病的病原学及免疫学研究仍然是国内外研究学者的长期课题。