3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗模型研究现状*

★ 雷婷 涂珺

(1.江西中医药大学药学院 南昌 330004；2.江西中医药大学中医基础理论分化发展研究中心/江西省病因生物学重点实验室 南昌 330004)

胰岛素抵抗(insulin resistance, IR)是胰岛素敏感性降低，即胰岛素与其特异性受体结合后生物效应低于正常。IR主要表现为脂肪、肝脏和骨骼肌等三大外周组织对葡萄糖的摄取异常及肝糖输出增多。脂肪IR是指脂肪组织对葡萄糖的利用能力降低，即外周脂肪组织在一定浓度的胰岛素作用下不能有效地对葡萄糖进行摄取和利用，使得糖耐量降低。脂肪组织是活性内分泌器官，其产生的被称为“脂肪因子”的内分泌物质，包括瘦素、脂联素、内啡肽、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)、抵抗素、内脂素等，这些脂肪因子数量变化影响胰岛素生物效应发挥，包含脂肪胰岛素敏感性及通过血液远端调控骨骼肌和肝脏胰岛素敏感性[1]。

从细胞和分子水平深入研究可以使我们更易理解复杂疾病如糖尿病组织与器官的行为。利用不同药物诱导使体外细胞对胰岛素敏感性降低，细胞在相同胰岛素作用下对葡萄糖消耗量降低，产生IR[2]。优化构建稳定的体外IR细胞模型可以直观快捷探讨IR的发病机制及相应药物的筛选。人体原代脂肪细胞提取过程复杂，所需培养条件比小鼠更为复杂，脂肪组织不易处于同一水平导致实验结果难以重复，不利于细胞水平研究IR。有研究表明利用人体脂肪组织与小鼠脂肪组织体外细胞实验结果并无显著种属差异，因而从易喂养而且成本低的小鼠中提取前脂肪细胞，诱导分化成熟脂肪细胞后建立IR细胞模型是较佳的选择。

3T3-L1脂肪细胞由Swiss小鼠胚胎成纤维细胞诱导分化而来，分化完全的 3T3-L1 脂肪细胞具有高胰岛素敏感性且稳定性较好，因此 3T3-L1 脂肪细胞是广泛采用的IR细胞模型[3]。考虑到脂肪是率先发生IR的部位，IR最主要的因素是糖脂代谢紊乱，通过高糖、高脂及炎症因子等不同诱导方法建立脂肪细胞IR模型，对差异化研究厘清IR发生发展机制有重要的意义。

1 糖代谢紊乱诱导IR-3T3-L1细胞模型

糖代谢紊乱主要表现为血糖浓度比正常过高或过低，糖尿病患者在糖代谢紊乱的同时，常伴有脂肪和蛋白质代谢的异常。目前有高糖、高胰岛素、地塞米松及高糖与高胰岛素联合作用等多种方法诱发糖代谢紊乱建立IR-3T3-L1模型。

1.1 高糖和/或高胰岛素 吴汉荣等[4]研究发现胰岛素在低糖时可显著促进3T3-L1细胞葡萄糖转运，而高糖作用下则抑制葡萄糖转运。由此可见，高糖刺激下，脂肪细胞对胰岛素的敏感性降低，对葡萄糖的摄取能力减弱诱发脂肪IR。刘晓华等[5]研究发现10-7mmol· L-1胰岛素可诱导3T3-L1脂肪细胞产生IR并可以稳定48h。Tan等[6]发现10nmol· L-1胰岛素持续作用16h可诱导IR-3T3-L1细胞模型，下调GLUT4蛋白表达和GLUT4膜转位，影响了大量AKT底物磷酸化水平，阻碍PI3K/AKT通路相关胰岛素信号传递。

高糖高胰岛素是近年来常用诱导建立IR-3T3-L1脂肪细胞模型的药物，其优越性在于可以更好模拟IR患者高糖高胰岛素的体内环境，避免造模过程中对细胞造成急性损伤及单一因素造模的不准确性，较其它造模方法更稳定，可为后期的实验提供更准确的结论。陈立等[7]用100nmol· L-1胰岛素和DEME高糖培养基联合诱导48h后，3T3-L1脂肪细胞葡萄糖消耗量和转运率都显著降低，说明葡萄糖在脂肪细胞中转运速率受葡萄糖浓度的影响。官滨斌等[8]在诱导IR-3T3-L1细胞建模结束后，加入相同浓度低糖 DEME培养基，胰岛素作用30 min后进行葡萄糖消耗量检测，减少了因葡萄糖浓度差异和胰岛素长时间作用带来的误差，较正确地表现细胞糖代谢能力和胰岛素敏感性。可见体内的长时间高浓度胰岛素和高浓度葡萄糖持续刺激是脂肪产生IR的主要因素之一。

1.2 地塞米松 地塞米松(dexamethasone，DEX)是人工合成的肾上腺糖皮质激素，其诱发IR的分子机制研究较为深入，主要为抑制胰岛素分泌及其信号转导途径来干扰脂肪对葡萄糖的利用[9-10]。使用地塞米松建立IR模型的方法应用较广，主要包括地塞米松单独作用、地塞米松加胰岛素联用和地塞米松与罗格列酮联用三种。

聂绪强等[11]研究发现在1μmol· L-1地塞米松、0.5mmol· L-11-甲基-3-异丁基黄嘌呤(IBMX)和10-6mol· L-1胰岛素诱导3T3-L1前脂肪细胞9d后分化为成熟脂肪细胞，继续用1 μmol·L-1地塞米松培养96h后成功诱导成IR-3T3-L1-IR脂肪细胞在36h内保持稳定IR状态。吴乃君等[12]研究发现1μmol· L-1地塞米松单独干预3T3-L1 脂肪细胞时，细胞对葡萄糖的摄取能力减弱，且地塞米松作用时间与脂肪细胞葡萄糖消耗量成反比，说明地塞米松诱发的IR模型适合慢性IR的发生条件。

杨桂枝等[13]研究显示地塞米松和胰岛素联合诱导3T3-L1细胞下调胰岛素受体底物-1(IRS-1)和葡萄糖转运蛋白-4(GLUT4)的mRNA和蛋白表达水平，导致细胞对葡萄糖的消耗减少从而引发IR。Sangeetha等[14]在采用地塞米松建立的IR-3T3-L1细胞模型中加入罗格列酮24h后细胞葡萄糖消耗量升高90%，GLUT4蛋白表达明显上调。此外，郭晓农等[15]采用罗格列酮联用地塞米松诱导建立IR-3T3-L1细胞模型，检测到3T3-L1细胞的摄糖量明显升高。这表明罗格列酮可以升高脂肪细胞对葡萄糖的摄取量，在一定程度上改善3T3-L1脂肪细胞IR。但罗格列酮具有改善IR的作用仅限于使用了地塞米松体外建模的脂肪细胞。

我们研究团队采用了地塞米松单独及联用罗格列酮诱导的两种IR-3T3-L1建模方法。罗新新等[16]使用1μmol·L-1地塞米松诱导24～120h建立IR-3T3-L1细胞模型，在诱导96h时，IR组与正常组葡萄糖消耗差值比为46.84%，细胞IR状态达到最佳。涂珺等[17]采用地塞米松与罗格列酮联合诱导24～84h建立IR-3T3-L1细胞模型，在72h葡萄糖消耗差值比例最大，为22.77%。研究还发现两种方法在IR-3T3-L1模型最佳时间点确立60h内均维持稳定，甘油三酯含量较正常组均显著升高但联用罗格列酮组的升高更为明显；GLUT4和脂联素mRNA和蛋白表达水平较正常组显著降低。单用地塞米松组GLUT4和脂联素mRNA和蛋白表达水平降低幅度更大，联用罗格列酮后，明显升高葡萄糖消耗量和GLUT4表达，与Sangeetha等[14]结果基本一致。

2 脂代谢紊乱诱导IR-3T3-L1细胞模型

各种研究表明肥胖是由脂代谢紊乱引发的。脂代谢紊乱是指机体中油脂的代谢易于正常，体内油脂过多容易引发糖尿病在内的各种代谢性疾病。软脂酸和油酸是游离脂肪酸(Free fatty acids，FFAs)主要组成物质。软脂酸是广泛存在于自然界中的高级饱和脂肪酸，几乎所有油脂中都含有数量不等的软脂酸组分。肥胖人群血浆 FFA水平显著升高诱发IR，而降低血浆FFA水平可以改善IR。从1963年，Randle等人提出，血浆中FFAs的增多在T2DM的IR发生发展中起重要作用。此后研究发现FFAs可引起肝脏、脂肪、肌肉组织IR及影响胰岛β细胞的胰岛素分泌[18]。建立FFAs诱导脂肪IR细胞模型，可以在体外深入研究模拟肥胖带来脂代谢紊乱进而引发糖代谢紊乱最终导致糖尿病的发病机制和干预药物。

FFAs可激活脂肪细胞中JNK 和 IKKβ/NF-κB炎症信号通路，抑制 InsR 和IRS-1 酪氨酸磷酸化，其抑制程度随FFAs浓度升高而增强，通过增加激酶PI3K和AKT的丝氨酸磷酸化，损害 GLUT4的膜转位影响葡萄糖的吸收诱发IR[6]。陈立等[7]研究发现0.5mmol·L-1软脂酸诱导24h后，游离脂肪酸组的GLUT4蛋白表达水平明显降低，随着时间的延长，游离脂肪酸组细胞的葡萄糖转运率明显增多。滕翠琴等[19]使用1 mmol· L-1的软脂酸对 3T3-L1 脂肪细胞作用24h后，细胞葡萄糖和FFAs消耗量减少成功诱导建立IR模型，一系列糖脂代谢关键酶和GLUT4的表达下调，上调负调控胰岛素信号的蛋白酪氨酸磷酸化酶-1B (PTP-1B) 的表达。Gao等[20]将高糖与高脂联用可造成 IR-3T3-L1。

佘美华等[21]采用300μmol·L-1棕榈酸处理3T3-L1脂肪细胞6h后，用浓度为50、100、200nmol·L-1胰岛素诱导检测细胞葡萄糖摄取情况。结果发现未经FFA处理的3T3-L1脂肪细胞葡萄糖消耗量随胰岛素浓度升高而逐渐增加；在50nmol·L-1胰岛素作用下，经FFA处理的脂肪细胞葡萄糖摄取量变化不明显，在100nmol·L-1胰岛素作用下，FFA处理组和未处理组细胞葡萄糖消耗量差别非常明显。

3 炎症因子诱导IR-3T3-L1细胞模型

有研究显示炎症因子可诱导建立IR-3T3-L1 脂肪细胞模型。炎症因子例如肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)、干扰素-γ(IFN-γ)等可介导细胞内炎症反应信号转导，诱导对胰岛素敏感的脂肪、肝和肌肉组织的IRS-1丝氨酸磷酸化，抑制酪氨酸磷酸化来阻碍胰岛素信号转导诱发IR形成[22]。

3.1 TNF-α TNF-α是参与机体的炎症反应的重要炎性介质，是多种信号通路的关键环节的多功能细胞因子。TNF-α也是脂肪组织中率先与肥胖和慢性系统炎性关联的炎症因子，其对IR的影响是多途径的。TNF-α可抑制GLUT4的表达及转位，降低葡萄糖转运；促进脂肪细胞脂解，增加FFAs在体内释放；抑制PPARγ和脂联素的生成，增加瘦素分泌；增加脂肪细胞中PTP-1B基因的蛋白表达，促进炎症因子IL-6、IL-8和IL-1β等的分泌，阻碍胰岛素受体信号中IRS-1 的酪氨酸磷酸化[23]。

于希忠等[24]采用10ng·mL-1TNF-α孵育3T3-L1细胞24 h，使脂肪细胞产生IR。郭红辉等[25]表明用TNF-α处理6h后，受胰岛素刺激的3T3-L1细胞对葡萄糖的摄取能力明显降低，12h可以判定脂肪细胞处于IR状态。章常华等[26]使用5、10、20μg·L-1TNF-α干预96h均能显著降低3T3-L1细胞对葡萄糖的消耗诱发IR。黄雌友等[27]发现胰岛素刺激下，TNF-α诱导24h的IR-3T3-L1脂肪细胞对葡萄糖摄取能力呈剂量依赖性降低。

3.2 IL-6 IL-6可由活化T细胞和B细胞、单核巨噬细胞、内皮细胞等多种细胞合成。为了解IL-6对脂肪IR的影响，曾天舒等[28]采用IL-6作用于脂肪3T3-L1细胞48h发现3T3-L1细胞对葡萄糖的摄取能力受到明显抑制，葡萄糖消耗量降低，细胞呈现IR状态，IRS-1蛋白表达水平和其酪氨酸磷酸化水平明显下降。Liu等[29]采用含有 TNF-α和 IL-6干预分化成熟的 3T3-L1 脂肪细胞 24h，模型组 TNF-α和 IL-6 基因mRNA及蛋白含量均明显高于正常组，IR-3T3-L1细胞中炎症通路蛋白IKKβ、NF-кB p65磷酸化水平升高而胰岛素信号通路蛋白IRS-1(Ser307)和 AKT磷酸化水平降低。此外，喻日成等[30]在分化成熟的3T3-L1脂肪细胞加入2ng·mL-1的INF-γ，诱导后IL-6、iNOS、MCP-1表达均明显升高，表明INF-γ可诱导脂肪细胞的炎症反应。

4 小结

现在糖尿病已成为国际的重大公共健康卫生问题，对糖尿病的发病机制及其防治的药物研究不仅迫在眉睫，也是医学工作者的一项重大挑战。建立合适的体外IR模型对从细胞水平阐明IR作用机制具有重要的现实意义，对体外快速筛选改善IR的天然产物和药物也有一定的帮助。建立IR脂肪细胞模型的方法很多，使用不同的方法诱导建立脂肪细胞IR模型，可以用于研究不同原因引发的糖尿病的发病机制及针对性使用药物厘清干预脂肪IR作用机制是糖尿病基础研究的主要内容。这些研究可以为临床治疗选择糖尿病药物及药物组合提供理论依据和用药指导，从而使广大糖尿病人群能够获得有效的治疗。

[1]Smitka K1, Mare ováD2. Adipose tissue as an endocrine organ:An update on pro-inflammatory and anti-inflammatory microenvironment[J].Prague Med Rep, 2015, 116(2): 87-111.

[2]张泽生，李雨蒙，张梦娜，等. 胰岛素抵抗细胞模型的建立及药物评价的研究进展. 中国食品添加剂，2016(10): 198-203.

[3]屠亦文，郝瑞福. 胰岛素抵抗3T3-L1脂肪细胞模型及中药有效成分的干预作用[J].吉林中医药，2014，34(11): 1 170-1 173.

[4]吴汉荣，向光盛，卢慧玲，等. 高浓度葡萄糖诱导脂肪细胞产生胰岛素抵抗[J].华中科技大学学报(医学版)，2006，35(1): 66-67．

[5]刘晓华，江湖，李海星，等. 胰岛素诱导3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗模型的建立[J].食品科学，2012，33(19): 249-253.

[6]Tan SX, Fisher-Wellman KH,Fazakerley DJ, et al. Selective insulin resistance in adipocytes[J].J Biol Chem,2015, 290(18): 11 337-11 348.

[7]陈立，杨明炜，库宝庆，等. 3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗模型建立的3种方法对葡萄糖转运时效关系的影响[J].武汉大学学报(医学版)，2012,33(4): 491-494.

[8]官滨斌，王丽静，刘小莺，等. 内质网应激可介导3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗[J].福建医科大学学报，2012，46(3): 165-168.

[9]Nicastro H, Zanchi NE, da-Luz CR, et al. Effects of leucine supplementation and resistance exercise on dexamethasone-induced muscle atrophy and insulin resistance in rats[J].Nutrition, 2011, 28(4): 465-471.

[10]Rafacho A, Abrantes JL, Ribeiro DL, et al. Morphofunctional alterations in endocrine pancreas of short-and long-term dexamethasone-treated rats[J].Horm Metab Res, 2011, 43(4): 275-281.

[11]聂绪强，杨建文，史海霞，等. IR-3T3-L1脂肪胰岛素抵抗细胞的建立[J].南方医科大学学报，2015，35(1): 103-108.

[12]吴乃君，金秀平，盛佳曦，等. 地塞米松对3T3-L1脂肪细胞的影响及二甲双胍的干预作用[J].中国煤炭工业医学杂志，2013，16(12): 2 042-2 044.

[13]杨桂枝，高小平，晏菊芳，等. 地塞米松和胰岛素诱导3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗的分子机理[J].西南师范大学学报(自然科学版)，2003,28(3): 460-464.

[14]Sangeetha KN, Shilpa K, Jyothi Kumari P, et al. Reversal of dexamethasone induced insulin resistance in 3T3-L1 adipocytes by 3β-taraxerol of Mangifera indica[J].Phytomedicine, 2013, 20(3-4): 213-220.

[15]郭晓农. 罗格列酮对3T3-L1脂肪细胞增殖及胰岛素抵抗的作用[J].西北民族大学学报(自然科学版)，2011，32(83): 58-60+64.

[16]罗新新，徐国良，黎宇，等.葛根调节脂肪细胞糖脂代谢改善胰岛素抵抗的研究[J].中国中药杂志，2016，41(14): 2 687-2 694.

[17]涂珺，罗新新，李冰涛，等. 小檗碱对脂肪胰岛素抵抗PPARγ及脂肪分泌因子表达的影响[J].中国中药杂志，2016，41(11): 1 983-1 989.

[18]Esser N,Legrand-Poels S,Piette J, et al. Inflammation as a link between obesity, metabolic syndrome and type 2 diabetes. Diabetes Res Clin Pract, 2014, 105(2) : 141-150.

[19]滕翠琴，刘仲华，龚受基，等. 六堡茶对胰岛素抵抗3T3-L1脂肪细胞糖脂代谢的影响[J].茶叶科学，2014，34(3): 230-238.

[20]Gao C, Zhu C, Zhao Y, et al. Mitochondrial dysfunction is induced by high levels of glucose and free fatty acids in 3T3-L1 adipocytes[J].Mol Cell Endocrinol, 2010, 320(1-2): 25-33.

[21]佘美华，侯洪杰，胡小波，等. 褪黑素改善胰岛素抵抗3T3-L1脂肪细胞葡萄糖的摄取[J].中国生化药物杂志，2011，32(4): 281-283.

[22]张豫文，洪洁. 炎症因子与胰岛素抵抗[J].诊断学理论与实践，2010(1)：90-94.

[23]杨永青，杨明庆. 肥胖诱发胰岛素抵抗的炎性机制[J].中国生物化学与分子生物学报，2012，28(8): 692-699.

[24]于希忠，刘佳，程罗根，等. 小檗碱对3T3-L1脂肪细胞炎症因子分泌和炎症信号通路的影响[J].南京中医药大学学报，2010，26(3): 217-219+247-248.

[25]郭红辉，凌文华. JNK介导TNF-α和H2O2引起的脂肪细胞胰岛素抵抗[J].中国病理生理杂志，2010，26(2): 349-352.

[26]章常华，胡宪红，张忠伟，等. 肿瘤坏死因子-α诱导3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗模型的建立[J].中国实验方剂学杂志，2012，18(18): 171-174.

[27]黄雌友，吴卫国，王卓平，等. 肿瘤坏死因子-α诱导3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗的机制[J].海南医学，2015，26(17): 2 510-2 512.

[28]曾天舒，潘世秀，陈璐璐. 白细胞介素6导致脂肪细胞胰岛素抵抗机制的初步探讨[J].中国病理生理杂志，2007，23(7): 1 331-1 334.

[29]Liu K, Wang H, An Y, et al. Resveratrol modulates adipokine expression and improves insulin sensitivity in adipocytes: Relative to inhibition of inflammatory responses[J].Biochimie, 2010, 92(7): 789-796.

[30]喻日成，罗建华，范元硕，等. DHA对IFN-γ诱导的3T3L1脂肪细胞MHCⅡ及炎症分子表达的影响[J].重庆医学，2015，44(36): 5 068-5 070.