益气去喘汤微生物限度检查方法验证试验

陈俊涛

[摘要]目的通过筛选合理的检查方法，为益气去喘汤提供正确的微生物限度检查标准。方法以据《中国药典》2015年版规定，分别采用常规法、平皿法、培养基稀释法对样品进行微生物限度试验。结果平皿法.对大肠埃希菌、白色念珠菌、黑曲霉的回收率均能达到要求；培养基稀释法（0.5mL/皿）对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的回收率能达到要求；对大肠埃希菌、沙门菌的检查方法可使用常规方法进行检查。结论试验中选择的酵母菌、细菌、霉菌的计数方法，以及控制菌所选用的验证方法适用于益气去喘汤的微生物限度检查，本试验可达到检测目的。

[关键词]益气去喘汤；微生物限度检查；验证试验；制订检查标准

[中图分类号]R286.0 [文献标识码]A [文章编号]2095-0616（2017）17-43-05

益气去喘汤是我院多年临床经验处方，主要由黄芪、党参、枇杷叶、前胡、桔梗、杏仁等药物组成的，具有益气、宣肺、化痰、平喘等功效，治疗肺气虚引起的哮喘、咳嗽等症状，疗效显著，安全可靠，无明显副作用。在制剂检验过程中，为保证微生物限度检查的科学性和准确性，以及确保本试验选择的检测方案适用于益气去喘汤中霉菌、酵母菌、细菌计数的检测，以及控制菌的检定，该验证方案采用《中国药典》2015年版一部附录XⅢc微生物限度检查方法进行验证试验，结果报道如下。

1试验材料

1.1试药

益气去喘汤由本院煎药室负责供应。

1.2试验所需的培养基

营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、胆盐乳糖培养基、改良马丁培养基、营养肉汤培养基、改良马丁琼脂培养基等。上述所用的培养基均系北京三药科技开发公司生产。

1.3本试验所用菌种

枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）[CMCC（B）63501]、大肠埃希菌（Escherichia coli）[CMCC（B）44102]、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[CMCC（B）26003]、黑曲霉（Aspergillus niger）[CMCC（F）98003]、白色念珠菌（Candida albicans）[cMCC（F）98001]、乙型副伤寒沙门菌（Salmonellaparatyphi B）[CMCC（B）50094]。枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、黑曲霉、白包念珠菌、乙型副伤寒沙门菌均由中国医学菌种保藏中心提供。

2试验验证步骤

2.1试验所用菌液的配制

2.1.1吸取在35℃经过24h培养的枯草芽孢杆菌、金黄葡萄球菌、沙门菌、大肠埃希菌的肉汤培养物1mL，使用0.9%无菌氯化钠溶液10倍量进行稀释，枯草芽孢杆菌至10^-5、金黄色葡萄球菌至10^-7、沙门菌至1@8，大肠埃希菌至10-7、大约50～100cfu/mL，以备试验使用。

2.1.2吸取在26℃经过24h培养的白色念珠菌液体培养物1mL，使用0.9%氯化钠无菌溶液10倍量进行稀释到10^-5，大约50～100cfu/mL，以备试验使用。

2.1.3吸取在26℃经过7d培养的黑曲霉的改良马丁琼脂斜面培养物，加5mL含0.05%（mL/mL）聚山梨酯80的0.9%氯化钠无菌溶液，洗脱掉孢子。再吸取出含孢子的混悬液，加0.05%（mL/mL）聚山梨酯80的0.9%氯化钠无菌溶液10倍量进行稀释到104，大约50～100cfu/mL，以备试验使用。

以上所使用的各株菌的培养物都是三代培养物。

2.2试验所用菌液的测定

2.2.1吸取以上枯草芽孢杆菌10^-5、金黄葡萄球菌10^-7、沙门菌10^-8、大肠埃希菌10^-7级稀释后的溶液的量分别为1mL，使用45℃营养琼脂培养基20mL分别注皿，并分别进行平行测定此二皿，调温至35%，静止48h后计算菌落数，大约50～100cfu/mL。测定的结果见表1。

2.2.2分别吸取以上配制的含黑曲霉104的孢子混悬溶液1mL、白色念珠菌10^-5稀释溶液1mL，再取45℃玫瑰红钠琼脂培养基20mL分别进行注皿后，然后再分别平行测定此二皿，调温至26%，静止培养，每日观察，计算菌落数，大约50～100cfu/mL。测定的结果见表1。

2.3试验验证霉菌、酵母茵、细菌的计数方

依据《中国药典》2015年版一部（附录XⅢC）微生物限度检查法中计算菌落数的方法进行验证测定。试验所用供试溶液的配制：量取供试药液10mL，缓缓加入氯化钠一蛋白胨无菌缓冲溶液至100mL，调至pH7.0，用玻棒搅拌混合均匀，此为供试溶液备用。

2.3.1平皿法结果见表2～6。

2.3.1.1试验组 分别吸取上述供试溶液，按每个皿为1mL的量加入供试溶液，再加入上述已配制好的试验菌50～100cfu，随即倾入瓊脂培养基，放在规定的温度下静止3～5d，每天按时观察。

2.3.1.2菌液组 将相同体积的供试溶液换成氯化钠-蛋白胨无菌缓冲溶液（pH7.0），以照试验组的方法进行验证检测。

2.3.1.3试验对照组 对照组的试验方法除不加菌液外，其他均与试验组相同。

2.3.1.4计算试验组的加菌回收率 根据下述计算公式计算回收率。

试验组的加菌回收率=（试验组的平均菌落数-供试品对照组的平均菌落数）/菌液组的平均菌落数×100%。

2.3.2培养基稀释法结果见表5～6。

2.3.2.1试验组 分别吸取上述供试溶液，按每个皿为0.5、0.2mL的量注入平皿，再注入上面已配制好的试验菌50-100cfu，随即倾入琼脂培养基，放在规定的温度下静止3～5d，每天按时观察。

2.3.2.2菌液组 测定方法与平皿法的菌液组相同。

2.3.2.3供试品对照组 试验方法仅不加菌液之外，其他均与试验组相同。

2.3.2.4计算试验组的加菌回收率 根据下述计算公式计算回收率。

试验组的加菌回收率=（试验组的平均菌落数-供试品对照组的平均菌落数）/菌液组的平均菌落数×100%。

2.4验证控制菌的测定方法

2.4.1验证大肠埃希菌的测定方法 根据常规法进行试验，试验数据如表7。

2.4.1.1试验组 在胆盐乳糖培养基中加入供试溶液，按每100mL胆盐乳糖培养基中加入供试溶液10mL，再注入上面已配制好的大肠埃希菌50～100cfu，放在35℃温度下静止24h，根据相应控制菌的测定方法进行试验。

2.4.1.2阴性试验对照组 将相同体积的供试溶液换成氯化钠一蛋白胨无菌缓冲溶液（pH7.0），试验方法仅不加菌液之外，其他均与试验组相同。

2.4.1.3阳性试验对照组 将相同体积的供试溶液换成氯化钠一蛋白胨无菌缓冲溶液（pH7.0），其他试验方法均与试验组相同。

2.4.1.4供试品组 在胆盐乳糖培养基中加入供试溶液，按每100mL胆盐乳糖培养基中加入供试溶液10mL，放在35℃温度下静止24h，根据相应控制菌的测定方法进行试验。

2.4.2验证沙门菌的测定方法 根据常规法进行试验，试验数据如表7。

2.4.2.1试验组 在营养肉汤培养基中加入供试品，按每200mL营养肉汤培养基中加入供试品10g，使其混合均匀，再加入上面已配制好的沙门菌50～100cfu，放在35℃温度下静止24h，根据相应控制菌的测定方法进行试验。

2.4.2.2阴性试验对照组 吸取上述营养肉汤培养基200mL，放在35℃温度下静止培养24h，根据相应控制菌的测定方法进行试验。

2.4.2.3陽性试验对照组 在营养肉汤培养基中加入沙门菌，按每200mL营养肉汤培养基中加入沙门菌50～100cfu，使其混合均匀，放于35℃温度下静止24h，根据相应控制菌的测定方法进行试验。

2.4.2.4供试品组 在营养肉汤培养基中加入供试品，按每200mL营养肉汤培养基中加入供试品10g，使其混合均匀，放于35℃温度下静止24h，根据相应控制菌的测定方法进行试验。

3讨论

3.1验证方法可用

在验证霉菌、细菌、酵母菌数的检查方法试验中，根据试验表2～6中的数据可知，平皿法对白色念珠菌、大肠埃希菌、黑曲霉的回收率均大于70%，都达到《中国药典》2015年版一部附录XⅢc微生物限度的要求，对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的回收率均小于70%；采用培养基稀释法（0.5mL/皿），对金黄色葡萄球菌的回收率能达到要求；采用培养基稀释法（0.2mL/皿），对枯草芽孢杆菌的回收率能达到要求；在验证沙门菌和大肠埃希菌的检查方法试验中，根据表7中的数据可知，阴性对照组和供试品组未检出控制菌，而试验组和阳性对照组均检出控制菌，因此，对沙门菌和大肠埃希菌可采用常规法进行检查。

3.2验证结果可靠

从上述试验结果可知，对益气去喘汤进行微生物限度检查时，可以用培养基稀释法（0.2mL/皿）对细菌数进行测定，可以用平皿法对霉菌、酵母菌数进行测定，可以用常规法对沙门菌、大肠埃希菌进行检查。

3.3验证目的达到

根据上述结论，制订出益气去喘汤的微生物限度检查标准，具体为：吸取该汤药加氯化钠一蛋白胨的无菌缓冲液（pH7.0）配制为1：10的供试液。细菌的计数使用培养基稀释法（0.2mL/皿）进行检查，霉菌和酵母菌的计数使用平皿法检查，沙门菌、大肠埃希菌的检查用常规法，结果应符合《中国药典》2015年版一部附录XⅢC微生物限度的规定。

（收稿日期：2017-06-01）