澄清剂对蓝靛果果汁活性成分和特性的影响

曾德永，张立钢，赵玉红*

（1.东北林业大学林学院，黑龙江 哈尔滨 150040；2.哈尔滨工业大学化工与化学学院，黑龙江 哈尔滨 150001；3.东北农业大学食品学院，黑龙江 哈尔滨 150030）

蓝靛果忍冬（Lonicera caerulea L.）是忍冬科忍冬属落叶灌木植物，又名蓝靛果、黑瞎子果、山茄子果等，主要分布在我国的东北、华北及俄罗斯的远东地区和日本等地[1-3]。蓝靛果果实中含有大量的维生素、矿物质、有机酸和糖类，同时含有大量的功能活性物质，如儿茶酸、花色苷、芸香苷等，具有抗氧化、抗癌、提高血球蛋白数和降压的作用[4]。蓝靛果果实多汁，种子极小，出汁率极高，被作为生产果汁和果酒的理想原料[5-6]，果汁为鲜艳的深玫瑰色，是生产天然植物色素的良好原料[7]。

果汁的澄清可以分为电荷中和法、酶法和物理法3 种[8]。不同的澄清方法对果汁的澄清效果不同。莫树平等[9]使用自然澄清法、明胶-单宁法、海藻酸钠-碳酸钙法、聚乙烯聚吡咯烷酮（polyvinylpyrrolidone，PVPP）法、甘草浸提液澄清法、甲壳素澄清法、冷冻澄清法等对龙眼果汁进行澄清实验，结果表明明胶-单宁法和甘草浸提液澄清法对龙眼果汁的澄清效果不理想，且易产生二次沉淀；经PVPP法处理过的龙眼果汁近乎透明，澄清后龙眼风味改变不大。Ozge等[10]研究了利用壳聚糖澄清石榴汁并研究其在储藏期间质量的变化，结果表明，石榴汁在贮藏过程中质量的变化主要表现为浊度、可滴定酸度、总酚含量的变化。Betul等[11]研究了壳聚糖、PVPP、黄原胶、白蛋白、酪蛋白等物质对石榴汁的澄清效果，并研究了这些澄清剂对其活性成分的影响，结果表明黄原胶对花色苷的影响较其他澄清剂小，而且用黄原胶澄清后总的碳水化合物保留最多，该实验表明黄原胶是良好的果汁澄清剂。酶是常用的澄清剂，王秀松等[12]研究了加果胶酶澄清果汁对果汁质量的影响。田金辉[13]则研究了果胶酶和纤维素酶对黑莓汁澄清处理后果汁中含有的花色苷含量会下降，总酚类物质有所增加。刘国凌等[14]采用果胶酶和纤维素酶复合澄清岗稔汁。王素雅等[15]研究了果浆酶对香蕉汁的澄清效果。Lettera等[16]利用真菌漆酶澄清橘子汁，对其中的活性物质进行测量，证明黄烷酮的含量没有减少，漆酶没有影响活性成分的含量。Maktouf等[17]利用真菌果胶分解酶对柠檬汁进行澄清研究，该酶对果汁的澄清效果良好，且贮藏过程中果汁的浊度等指标并没有明显变化。

目前对蓝靛果的研究大都集中于研究其成分的含量和功能性方面，对蓝靛果经过一系列工艺制成蓝靛果果汁后其活性成分受到的影响和感官特性等方面的变化研究比较少，有关蓝靛果经澄清剂处理后果汁的活性成分以及特性变化的研究鲜见报道。本实验以自然澄清汁和原果汁为对照，研究8 种澄清剂（壳聚糖、PVPP、白蛋白、干酪素、黄原胶、果胶酶、纤维素酶、明胶）对蓝靛果果汁活性成分（多酚、花色苷、黄酮、单宁）和特性（pH值、透光率、褐变指数、L*值）的影响，为蓝靛果果汁的加工利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

蓝靛果 黑龙江省尚志野浆果有限责任公司。

果胶酶、纤维素酶、白蛋白、酪蛋白、PVPP、明胶、黄原胶、壳聚糖、福林-酚、没食子酸均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

ALC-110.4电热恒温水浴锅 北京市永光明医疗仪器厂；DHG-9070A电热恒温鼓风干燥箱 上海精宏实验设备有限公司；722型可见分光光度计 上海光谱仪器有限公司；WBL25B26榨汁机 广东佛山美的公司。

1.3 方法

1.3.1 蓝靛果果汁的制备

1.3.1.1 原果汁的制备

将冷冻的蓝靛果在室温自然解冻，用榨汁机进行榨汁，经4 层纱布过滤，在90 ℃、5 min条件下进行灭酶处理，得到原果汁。

1.3.1.2 自然澄清果汁的制备

将1.3.1.1节所得果汁在室温条件下放置16 h，3 500 r/min离心10 min得自然澄清汁。

1.3.1.3 不同澄清剂对果汁的处理

将1.3.1.1节所得果汁分别用PVPP、白蛋白、干酪素、果胶酶、黄原胶、壳聚糖、明胶、纤维素酶8 种澄清剂对果汁进行澄清处理：1）PVPP澄清处理：在反应温度20 ℃、处理时间2 h时，PVPP添加量分别为0.1、0.3、0.5、0.7、0.9 g/L。2）白蛋白、干酪素、黄原胶澄清处理：在反应温度4 ℃、处理时间16 h条件下，白蛋白、干酪素添加量分别为0.062 5、0.125、0.250、0.375、0.500、0.625、0.750、0.875、1.0 g/L，黄原胶添加量分别为0.05、0.075、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60、0.70、 0.80、0.90、1.00 g/L。3）果胶酶、纤维素酶澄清处理：在反应温度45 ℃、酶解时间90 min条件下，果胶酶添加量分别为0.02、0.04、0.06、0.0 8、0.10、0.12 g/L，纤维素酶添加量分别为0.5、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 g/L。4）壳聚糖澄清处理：在反应温度20 ℃、处理时间10 h条件下，壳聚糖添加量分别为0.1、0.25、0.5、0.75 、1.0 g/L。5）明胶澄清处理：在反应温度20 ℃、处理时间6 h条件下，明胶添加量分别为0.05、0.075、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60、0.70、 0.80、0.90、1.00 g/L。

按上述方法对果汁进行澄清处理后，3 500 r/min离心10 min，再以透光率为指标研究澄清剂对果汁澄清效果的影响。

1.3.2 果汁特性的测定

1.3.2.1 果汁透光率的测定

透光率反映果汁体系的颗粒悬浮情况和浑浊程度，果汁的透光率越高表示澄清效果越好，本实验将制得的澄清汁用水1∶1稀释后在660 nm波长处直接测定透光率为评价指标，以蒸馏水为参比[18]。

1.3.2.2 颜色的测定

将制得的澄清汁用水稀释50 倍后，在相同条件下对澄清处理后果汁的L*、a*、b*值进行测定，并计算出果汁的褐变指数（C）[19]，如式（1）所示：

1.3.2.3 pH值的测定

采用pH计测定。

1.3.3 果汁中活性成分的测定

1.3.3.1 多酚的测定

以没食子酸为标品，采用Folin-Ciocalteu比色法[20]，纵坐标为吸光度，横坐标没食子酸浓度，得到回归方程y=0.004 5x-0.008 2，R2=0.999 2。

1.3.3.2 花色苷的测定

缓冲液的配制：pH 1.0缓冲液：0.2 mol/L KCl-0.2 mol/L HCl（25∶67，V/V），pH 4.5缓冲液：1 mol/L NaAc-1 mol/L HCl-水（100∶60∶90，V/V）。测定：取1 mL溶液，分别用pH 1缓冲液和pH 4.5缓冲液稀释至5 mL，置于暗处平衡2 h，以蒸馏水作对照，用可见分光光度计，在510 nm波长处测定光密度（OD）值。花色苷含量计算如下所示：

式中：TAcy为花色苷含量/（mg/100 g）；DV为稀释体积；VF为稀释倍数；W为样品质量；T为总消光值。

1.3.3.3 单宁的测定

采用FD法[21]，以单宁酸为标准品。绘制标准曲线，纵坐标为吸光度，横坐标为单宁酸质量浓度，得到回归方程y=74.75x＋0.031 2，R2=0.997 4。

1.3.3.4 黄酮的测定

采用分光光度计法，以芦丁为标品，绘制标准曲线，纵坐标为吸光度，横坐标为芦丁质量浓度，得到回归方程y=14.378x-0.005 9，R2=0.999 4。

1.4 数据统计分析

每组实验的每个样品平行3 次，每个数量分析进行2 次，数据用s表示。采用Stata 14进行显著性分析和相关性分析，采用Orign 15作图。

2 结果与分析

2.1 澄清剂对果汁特性的影响

不同澄清剂对果汁的特性影响不同，果汁的特性影响着果汁的感官品质，分别选取不同澄清剂处理下获得的最高透光率以及在此条件下果汁的褐变指数、L*值和酸度等果汁的特性进行研究。

2.1.1 澄清剂对果汁透光率的影响

透光率是衡量果汁澄清效果的最主要指标，不同澄清剂的澄清机理不同，因此最后果汁的透光率也不同，果胶酶、纤维素酶主要是靠降解果汁中的果胶与纤维素来达到澄清的效果[22]。明胶、壳聚糖则是与果汁中的果胶、纤维素、单宁等带负电荷的物质发生电性中和，从而破坏果汁的稳定胶体体系，发生絮凝并吸附其他悬浮物质而发生沉淀[23]。而黄原胶、PVPP主要是靠大分子的吸附作用来达到澄清目的[24]。

图1 不同澄清剂对果汁透光率的影响Fig. 1 Effects of different clarifying agents on transmittance

如图1所示，透光率最大的是经PVPP处理后的果汁，为74.3%（P＜0.05），白蛋白处理后的透光率次之，并且两者之间差异显著（P＜0.05）。透光率最小的是原汁，且原汁与其他澄清剂处理后果汁的透光率之间差异显著（P＜0.05），这说明上述澄清剂的澄清效果显著。纤维素酶和果胶酶处理后的果汁透光率差异不显著（P＞0.05），并且比自然条件下澄清处理的透光率小，这与谢志镭等[25]研究中用PVPP、明胶、果胶酶对蓝莓果汁澄清处理的结果相同。这可能是用果胶酶和纤维素酶时没有达到最佳条件，作用的时间短，导致最后透光率没有自然澄清的透光率大。而用壳聚糖、明胶自然澄清处理后的果汁透光率之间差异不显著（P＞0.05）。

2.1.2 澄清剂对果汁pH值、L*值、褐变指数的影响

L*值表示亮度，其值越大，果汁的颜色越亮，L*值能较好地反映汁的褐变程度[26]。褐变指数和L*值一样也是衡量果汁褐变程度的一个重要指标。

表1 澄清剂对果汁pH值、L*值、褐变指数的影响Table1 Effects of different clarifying agents on pH, L* value and browning index

由表1可知，各种澄清处理对果汁的pH值差异不显著（P＞0.05），这表明上述澄清方法对果汁的pH值没有影响。然而原果汁的L*值却与经其他澄清处理后果汁差异显著（P＜0.05），纤维素酶和果胶酶处理后果汁的L*值差异性不显著（P＞0.05）。这可能是因为处理时间相同，从而导致果汁的颜色没有差异。从表1可以看出，经PVPP处理后的果汁L*值最大，为31.500，原汁L*最小，为12.500；经PVPP处理后的果汁透光率最大，原汁的果汁透光率也最小，因此果汁的透光率可能影响果汁的L*值。经自然澄清和黄原胶处理后的果汁褐变指数较大，而且无差异显著性。而经果胶酶、纤维素酶处理的果汁和原汁之间的褐变指数是最小的，并且无显著性差异。这表明果汁的褐变指数可能与澄清的时间有关系，还与处理时的温度有关。

2.2 澄清剂对果汁活性成分的影响

在获得果汁最好的澄清效果时，还应该关注果汁中各种活性成分的含量，这类活性物质体现了果汁的营养价值。因此在各种澄清剂获得较好的澄清效果条件下，应对果汁中的活性成分多酚、黄酮和花色苷含量进行分析。

2.2.1 澄清剂对果汁中多酚含量的影响

酚类物质是一类连接一个或多个羟基的芳香环类有机化合物，蓝靛果中多酚类具有较强的抗氧化活性[27]。酚类物质的多少将直接影响到植物性产品的色泽、澄清度和稳定性等感官品质特性[28]。

由图2可知，果汁中多酚含量最高的是原汁，且与各种澄清剂处理后的果汁多酚含量存在显著性差异，这可以看出各种澄清剂对果汁中的总酚含量都存在显著性影响。经过PVPP处理后的果汁中多酚质量浓度最低为0.452 g/L，透光率却最大。这也能说明PVPP是通过其氨基化合物中的氢与多酚的氢氧基结合产生吸附作用，从而起到沉降单宁和色素的目的。也有研究表明PVPP能降低原果汁中50%的酚类物质。通过相关性分析，经PVPP处理后的果汁的透光率与多酚含量的相关系数R2为0.935 7，表现出极为相关。果胶酶、纤维素酶、自然澄清这3 种澄清处理方法的多酚含量差异不显著（P＞0.05），可能是由于果胶酶和纤维素酶处理果汁的条件相同。自然澄清处理和原果汁中的多酚存在差异，可能是因为自然澄清处理的16 h中，果汁中的多酚发生了降解。明胶和PVPP处理后果汁中多酚含量无差异，然而明胶处理后的透光率却显著低于用PVPP处理后的果汁，说明明胶处理的果汁中可能还有其他因素影响果汁的透光率。

图2 澄清剂对果汁多酚的影响Fig. 2 Effects of different clarifying agents on polyphenol content

2.2.2 澄清剂对果汁中单宁含量的影响

单宁属于多酚类化合物，能与蛋白质发生作用从而引起果汁的后混浊[29]，因此果汁中的单宁含量成为影响澄清汁稳定的主要因素。

图3 澄清剂对果汁中单宁含量的影响Fig. 3 Effects of different clarifying agents on tannin content

由图3所示，原汁中的单宁含量最高，且与其他各组差异显著（P＜0.05），说明各种澄清剂处理都能显著降低果汁中的单宁含量。自然澄清处理和经果胶酶、纤维素酶处理后的果汁中单宁含量差异不显著（P＞0.05），同时这3 组与其他组之间差异显著（P＜0.05）。经壳聚糖处理后的果汁单宁含量最低。

2.2.3 澄清剂对果汁中黄酮含量的影响

蓝靛果具有较高的营养价值和药用功能，其主要活性成分之一就是黄酮类化合物。蓝靛果中富含黄酮类化合物。黄酮类化合物具有抗肿瘤、抗氧化、防辐射等生物活性[30]。因此，在获得较好的澄清效果时最大限度地保留果汁中的黄酮类化合物也十分重要。

图4 澄清剂对果汁黄酮含量的影响Fig. 4 Effects of different clarifying agents on flavonoid content

由图4可以看出，原汁中的黄酮含量最高，且与果胶酶、纤维素酶、自然澄清处理后的果汁中的黄酮差异不显著（P＞0.05），这可能是果胶酶和纤维素酶没有破坏果汁中的黄酮。经PVPP处理后的果汁中的黄酮质量浓度最低，为0.035 mg/L，且与明胶处理后的差异不显著（P＞0.05），可以就看出这两种澄清剂能显著降低果汁中黄酮。

2.2.4 不同澄清剂对果汁中花色苷含量的影响

花色苷为类黄酮类化合物物质，是一种天然水溶性色素，有大量研究表明，花色苷具有抗疲劳、抗氧化作用、护肤、预防和治疗癌症、提高免疫力、预防心血管疾病、抗菌消炎、降低胆固醇等生物活性[31]。但是花色苷能影响果汁的澄清度，且发生褐变影响果汁的感官品质，但是作为果汁中的主要营养物质还是希望在保证果汁感官品质的情况下最大限度保留。

图5 澄清剂对果汁花色苷含量的影响Fig. 5 Effects of different clarifying agents on anthocyanin content

由图5可知，原汁中的花色苷含量最高，并与各组之间差异显著（P＜0.05），说明采用的澄清剂能显著降低果汁中花色苷含量。经过PVPP处理后的果汁中花色苷质量浓度最低，为16.69 mg/L，且与各组差异显著（P＜0.05）。与其他活性成分不同的是，纤维素酶和果胶酶处理后的果汁中的花色苷含量差异显著（P＜0.05）。纤维素酶、果胶酶、壳聚糖处理后果汁中的花色苷含量比其他方法处理后的果汁中的花色苷含量高，可能是因为处理时间比其他方法短，所以花色苷变性较少，经过干酪素、明胶、自然澄清处理后果汁中的花色苷含量差异不显著（P＞0.05）。

3 结 论

本实验采用8 种澄清剂对果汁进行澄清处理，实验结果表明经澄清处理后果汁的特性和活性物质含量均发生了明显地变化，不同的澄清剂对果汁的特性和活性成分含量的影响不同。8 种澄清剂都能显著提高果汁的透光率，其中PVPP的澄清效果最好，但是PVPP对果汁的特性与活性成分含量的影响却最为显著，能显著降低果汁活性成分含量。纤维素酶和果胶酶处理后果汁中的活性成分含量损失较少，L*值、褐变指数与原汁相比也没有显著性差异，但澄清度不高。结果表明使用单一的澄清剂来使果汁达到最好的澄清度与最大限度保留原汁的活性成分和特性是有一定难度的，这可能要通过选择澄清剂的复配使用实现。

[1] 周以良. 黑龙江树木志[M]. 哈尔滨: 黑龙江科技出版社, 1986: 145.

[2] 霍俊伟, 睢薇, 于泽源, 等. 野生蓝靛果忍冬人工驯化栽培[J]. 北方园艺, 2004(4): 31. DOI:10.3969/j.issn.1001-0009.2004.04.022.

[3] 包怡红, 王恩福, 应华章, 等. 蓝靛果果酒调配工艺的研究[J]. 酿酒,2007, 34(1): 92-94. DOI:10.3969/j.issn.1002-8110.2007.01.034.

[4] 杨玲. 蓝靛果提取物抗氧化及抗癌作用的研究[D]. 哈尔滨: 东北林业大学, 2009.

[5] 郭庆启, 张娜, 王硕, 等. 蓝靛果汁维生素C热降解动力学的研究[J].食品工业科技, 2012, 33(8): 92-94.

[6] 李淑芹, 李延冰. 野生植物蓝靛果营养成分研究[J]. 东北农业大学学报, 1994, 25(4): 401-404.

[7] 卢伟. 蓝靛果忍冬发展现状及其发展展望[J]. 农林科技, 2014(13): 43.

[8] 乔勇进, 徐芹, 方强, 等. 果汁澄清工艺研究进展[J]. 保鲜与加工,2007, 7(3): 4-7. DOI:10.3969/j.issn.1009-6221.2007.03.004.

[9] 莫树平, 柏建玲, 郑婉玲, 等. 龙眼果汁的澄清方法[J]. 工艺技术,2005, 26(9): 122-123. DOI:10.3969/j.issn.1002-0306.2005.09.035.

[10] OZGE T, TANER B. Clarification of pomegranate juice with chitosan:changes on quality characteristics during storage[J]. Food Chemistry,2015, 180: 211-218. DOI:10.1016/j.foodchem.2015.02.053.

[11] ERKAN-KOÇ B, TÜRKYILMAZ M, YEMIŞ O, et al. Effects of various protein-and polysaccharide-based clarification agents on antioxidative compounds and colour of pomegranate juice[J]. Food Chemistry, 2015, 184: 37-45. DOI:10.1016/j.foodchem.2015.03.064.

[12] 王秀松. 加果胶酶澄清果汁对果汁质量的影响[J]. 中国果菜,1989(1): 12-14.

[13] 田金辉. 黑莓汁的研制[D]. 无锡: 江南大学, 2006: 7-51.

[14] 刘国凌, 邝婷姗, 郭红辉, 等. 复合酶法制备澄清岗稔汁工艺优化[J]. 广东农业科学, 2014(24): 88-104. DOI:10.3969/j.issn.1004-874X.2014.24.020.

[15] 王素雅, 王璋. 果浆酶Pectinex SMASH澄清香蕉汁的机理[J].食品发酵工业, 2004, 30(4): 19-25. DOI:10.3321/j.issn:0253-990X.2004.12.005.

[16] LETTERA V, PEZZELLA C, CICATIELLO P, et al. Efficient immobilization of a fungal laccase and its exploitation in fruit juice clarification[J]. Food Chemistry, 2016, 196: 1272-1278. DOI:10.1016/j.foodchem.2015.10.074.

[17] MAKTOUF S, NEIFAR M, DRIRA S J, et al. Lemon juice clarification using fungal pectinolytic enzymes coupled to membrane ultrafiltration[J]. Food and Bioproducts Processing, 2014, 92(1): 14-19. DOI:10.1016/j.fbp.2013.07.003.

[18] JACOB N, SUKUMARAN R K, PREMA P. Optimization of enzymatic clarification of sapodilla juice: a statistical perspective[J].Applied Biochemistry and Biotechnology, 2008, 151(2): 353-363.DOI:10.1007/s12010-008-8198-z.

[19] BOUDHRIOUA N, GIAMPAOLI P, BONAZZI C. Changes in aromatic components of banana during ripening and air-drying[J].LWT-Food Science and Technology, 2003, 36(6): 633-642.DOI:10.1016/S0023-6438(03)00083-5.

[20] 王鸿飞. 果胶酶对草莓果汁澄清效果的研究[J]. 农业工程学报,2003, 19(3): 163-164. DOI:10.3321/j.issn:1002-6819.2003.03.038.

[21] 伍云卿. 果蔬中单宁测定技术研究[J]. 中国农学通报, 2015, 31(11):166-169.

[22] YAMASKI M, YASUI T, ARIMA K. Pectic enzymes in the clarification of apple juices. Part Ⅰ. Study on the clarification reaction in a simplified model[J]. Agricultural & Biological Chemistry, 1964,28: 779-787. DOI:10.1271/bbb1961.28.779.

[23] DAVIDSON V J, PATON D, DIOSADY L L, et al. A model for mechanical degradation of wheat starch in a single-screw extruder[J].Journal of Food Science, 1984, 49(4): 1154-1157. DOI:10.1111/j.1365-2621.1984.tb10416.x.

[24] YILDIRIM H K. Effects of fining agents on antioxidant capacity of red wines[J]. Journal of the Institute of Brewing, 2011, 117(1): 55-60.DOI:10.1002/j.2050-0416.2011.tb00443.x.

[25] 谢志镭, 林露, 严维凌. 不同澄清剂对黑莓果汁澄清效果的影响[J].中国食品学报, 2013, 13(4): 132-137.

[26] LÓPEZ-NICOLÁS J M, NÚÑEZ-DELICADO E, SÁNCHEZFERRER Á, et al. Kinetic model of apple juice enzymatic browning in the presence of cyclodextrins: the use of maltosyl-β-cyclodextrin as secondary antioxidant[J]. Food Chemistry, 2007, 101(3): 1164-1171.DOI:10.1016/j.foodchem.2006.03.018.

[27] HARDIE W J, CONSIDINE J A. Response of grapes to water-deficit stress in particular stages of development[J]. American Journal of Enology and Viticulture, 1976, 27(2): 55-61.

[28] 徐渊金, 杜琪珍. 花色苷分离鉴定方法及其生物活性[J]. 食品与发酵工业, 2006, 32(3): 67-72. DOI:10.3321/j.issn:0253-990X.2006.03.019.

[29] 潘叶, 王娟, 黄惠华. 菠萝果汁的浑浊及澄清机理的初步研究[J].现代食品科技, 2010, 26(10): 1071-1075. DOI:10.3969/j.issn.1673-9078.2010.10.009.

[30] 张敏, 张雁南, 刘刚, 等. 蓝靛果总黄酮的超声波提取研究[J]. 吉林工程技术师范学院学报, 2012, 28(6): 77-80. DOI:10.3969/j.issn.1009-9042.2012.06.028.

[31] 凌智群, 谢笔均. 莲房原花青素抗氧化损伤作用的研究[J]. 食品科学, 2002, 23(7): 98-100. DOI:10.3321/j.issn:1002-6630.2002.07.023.