印记基因在个体发展中的调控机制（综述）

肖　琳，杨海平，邓先强

（肇庆学院 体育与健康学院，广东 肇庆　526061）

哺乳动物继承2套染色体，分别来自父亲和母亲.对于每个基因，都有2个复制体.大多数基因的2个等位基因根据细胞类型分为表达基因和抑制基因.印记基因成串分布于基因组中，这些印记基因有1个离散的印记控制区域(ICR)来管理印记表达和父母等位基因的特异性标记，如DNA甲基化和翻译后组蛋白的修饰.印记基因和印记机制在老鼠和人类之间具有极高的相似性，研究人员已经使用实验小鼠模型和人类遗传疾病研究进行基因印记领域的探究.印记基因一般位于3-12基因簇，遍布于20 kb-3.7 Mb的DNA，也有实例表明单个印记基因的存在.[1]来自母源和父源的表达印记基因具有调控编码蛋白质和非编码RNA的作用.在过去的25年里很多研究一直围绕着基因的鉴别和印记基因表达的机制展开，这些研究表明，少量表现出印记表达的基因对哺乳动物的生长发育有很大的影响.现在，更多的印记基因被发现并被证实对众多不同的过程产生影响，包括胎儿生长的多能性、分化和表型.本文旨在综述印记基因调控机制和印记基因在不同发展阶段的不同作用，并详细阐述近期证实其功能重要性的研究.

1　印记基因的发生、维持和消除机制

1）印记基因的建立.1991年首次证实的印记基因（IGF2R、IGF2和H19）引发了对于印记建立、印记维持、印记擦除机制的阐释，这些机制共同控制着基因印记的时间和位置.印记控制区域的等位基因特异性DNA甲基化，是受精后赋予亲本特异性的最合理的解释.此外，配子形成期母源和父源基因处于分裂期能够被独立修饰，在此期间亲本基因组能够被区分开促使研究者分析其甲基化，这使得亲本特异性印记的假说得到加强.它最先表明H19/IGF2印记控制区域父本特异性甲基化在雄性性原细胞形成到减数分裂时期之前.[2]相比之下，母源特异性印记控制区域甲基化发生在卵母细胞形成之后,在此期间不同的印记控制区域在不同的时间段内发生不同的甲基化.[3]在这2种生殖细胞中，DNA的甲基化是通过DNA甲基转移酶3A(DNMT3A)和辅助蛋白DNMT3L来完成.[4]

2）印记基因的维持.受精后，尽管存在大范围的基因重组和DNA去甲基化,但此时亲本特异性印记必须维持.研究发现DNA甲基转移酶DNMT1在其中起维持作用，DNMT1可以通过甲基化新形成的DNA链，在受精后的重新编码中，可能通过反式作用因子来识别独特的顺式作用序列，为特异性印记提供保护.此外，锌指蛋白57(ZFP57)在调节印记基因中扮演着更特殊的作用.在胚胎早期，有可能是因为其他尚未查明的蛋白在ICR中维持DNA甲基化的作用.

3）印记基因的消除.最后，为完成印记周期，原始生殖细胞(PGCs)双亲的躯体模式印记被擦除.印记丢失包括一系列的主动丢失和被动丢失，涉及10-11易位酶(Tet)家族的甲基胞嘧啶双加氧酶，它有催化氧化5-甲基胞嘧啶成为5-羟甲基胞嘧啶以及DNA修复的作用.[5]此外，在原始生殖细胞中，由DNMT1维持的新复制DNA的甲基化受到抑制，可能与表观遗传学因子UHRF1的抑制有关，UHRF1是招募DNMT1必不可少的一个因子.

2　印记基因调节机制研究

2个已知的印记基因调控机制已被证实：绝缘子模型和ncRNA模型.[6]在绝缘子模型中，母源等位基因ICR未甲基化，被绝缘子蛋白CCCTC结合因子CTCF阻断.父源等位基因高甲基化使得CTCF无法结合，绝缘子无法形成.因此，IGF2基因被下游共享的增强子激活.在这个模型中，ICR表观遗传决定了位点的表达模式.另一个主要印记模型是ncRNA模型被运用在许多位点上，包括IGF2R/Airn和Kcnq1/Kcnq1ot1.在这种情况下，长ncRNA的启动子位于ICR.父源等位基因ICR未甲基化，因此可以允许ncRNA表达，在顺式区域中这反而会使其他基因沉默.这种机制来源可能是通过吸引抑制染色质信号的组分或通过阻止RNA聚合酶II在启动子上集结来形成.母源等位基因相对基因ICR甲基化导致ncRNA沉默，因此允许近端基因激活.在这种情况下，长ncRNAs的作用是促进相邻基因的沉默.

2.1　印记基因对胚胎生长发育的调节

单系老鼠胚胎发育受限的研究证实印记基因是生长发育所必须的.在老鼠身上，单系胚胎可以通过受精卵原核细胞核的移植产生，但雄核胚胎(来自2个父源原核)和雌核胚胎(来自2个母源原核)缺乏胚胎及胚胎外的组织，[7]说明印记基因在早期生长具有重要的作用.

关于印记基因调节生长，研究最充分的是父系表达IGF2基因，它是胎儿生长的正调节基因，而IGF2双等位基因不恰当的表达导致胚胎广泛增生或生长受限，[8]但母源表达的印记基因IGF2R可以使IGF2对胎儿生长的作用无效.IGF2R突变与过度生长和胚胎死亡相关，但在IGF2失效的情况下这2种表型不会发生.另一个对于胚胎发育起到广泛促进作用的是GRB10，其具有重要的生长调节作用，在大多数小鼠组织中母系表达.和IGF2一样，GRB10对生长的调控作用可能是通过胰岛素信号通路，结合胰岛素受体和胰岛素样受体IGF1R和IGF2R，且最近的研究也表明，GRB10是哺乳动物雷帕霉素靶蛋白mTOR的底物，通过mTOR介导的磷酸化和GRB10的稳定导致胰岛素信号降低.[9]

虽然IGF2、IGF2R、H19和GRB10对调节生长、控制通路有重要作用，但还有许多其他印记基因影响胚胎的生长是通过其他机制进行的.研究表明，一些印记基因，包括PEG1（MEST）、GTL2（MEG3）、CDKN1C、PLAGLl1和DLK1，在多种组织中相互协调，与IGF2和GRB10在“印记基因网”中共同调节生长.[10]转录因子ZAC1(Plagl1)是父系表达的印记基因，它已被证实在印记基因网中改变其表达，敲除该基因可导致小鼠宫内生长受限和新生小鼠死亡.此外ZAC1改变多个印记基因的表达，包括Cdkn1c和Dlk1，它通过结合其增强子来直接调节H19/IGF2.此外，H19集结MBD1有可能是反式印记基因网的调控因子.最后，BMI1是核心蛋白复合体1(PRC1)中的一员，在印记基因网络中也与其他印记基因的表达有关.[11]

尽管之前印记基因的研究运用的都是老鼠模型，在胚胎发育中印记异常导致的多种临床表型在人类中也是显而易见的.例如，贝克维斯-威德曼综合症（BWS）是一种先天过度生长的疾病，其与第11号染色体上印记基因相邻簇的基因缺陷有关.贝克维斯-威德曼综合症患者一般在出生前就已发生过度生长，出生之后可能发生新生儿低血糖，并伴随有巨舌、内脏肿大、半边肥大等病症.这种综合症大部分是由于KCNQ1OT1基因长ncRNA ICR甲基化的缺失引起的.这种甲基化的缺失导致ncRNA的双等位基因的表达，而通过KCNQ1OT1的调节对蛋白编码基因产生顺势作用抑制.与BWS表型有关的蛋白编码基因CDKN1C，其编码蛋白质充当细胞周期抑制剂和生长调节阀，CDKN1C的缺失或突变都会导致过度生长.[12]相比BWS，银罗素综合症（SRS）使婴儿在胎龄期长得很小，随后表现出侏儒症症状.SRS与H19/IGF2 ICR低甲基化高度相关，这导致H19双等位基因的表达和IGF2双等位基因的抑制.[13]BWS和SRS都与不对称生长和各种有害的表型相关，这表明这些印记基因在与生长相关的生物进程中具有至关重要的作用.

2.2　印记基因对大脑与神经发育的影响

印记基因在哺乳动物大脑的发育过程中同样具有特别重要和极其复杂的作用.这在研究单性生殖（PG，类似于雌核胚胎但由受精卵而来）和雄激素细胞（AG，只存在父系）在嵌合胚发育过程中对神经系统的作用中表现得尤为明显.PG和AG细胞在嵌合体大脑发育中仅有很少的作用，PG嵌合体具有较大的大脑和较小的身体，而AG嵌合体具有较小的大脑，但更大的身体.此外，PG和AG细胞对于大脑分区有影响，PG细胞在新皮质中更加普遍，而AG细胞在前视区和下丘脑更为普遍.这表明母源和父源基因组在神经元发育中具有不同的作用，这取决于他们中的许多关键印记基因及其调节功能.

许多印记基因在大脑中的表达模式和功能与在其他组织中是不同的.研究最充分的是UBE3A，其在大多数组织中双等位基因表达而在某些特定的神经元亚型中只有母源性表达.母源UBE3A缺陷导致天使综合征AS，AS是一种与认知和运动障碍有关的神经发育障碍性遗传病.[14]UBE3A是泛素连接酶，它可使靶蛋白降解.在体外培养中，UBE3A已被证明是泛素化蛋白质，对细胞周期调控有重要作用,如P53(TRP53)、HHR23A(RAD23A)和MGMT.[15]UBE3A一种存在于神经突触中的蛋白，同样被证明可以泛化ARC，其对于神经可塑性非常重要的谷氨酸受体内在化有促进作用.敲除小鼠UBE3A，大脑冻融物ARC和P53水平提高，这证明了UBE3A在神经元中具有调节蛋白质水平的作用.

其他显示大脑特异性表达模式的印记基因有助于大脑的高复杂性细胞类型的建立.PEG3是一个父系表达基因，通过与P53和促凋亡因子rBAX的相互作用控制神经元中的凋亡.[16]父源PEG3的缺失导致了新生儿特定大脑区域细胞凋亡的增加.这种凋亡最终使催产素分泌神经元总数减少，掩盖大脑不同区域细胞凋亡导致的性别特异性差异，这些区域涉及性行为，嗅觉和信息处理.另一个影响特异性神经元亚型的印记基因是父源表达的NDN基因，它可以编码一种蛋白质使其与P53以及多种生长因子相互作用从而影响神经元的分化和生长.[17]NDN突变的小鼠表现出下丘脑神经元密度的减少以及在轴突扩展上的形态异常，此外，大量的下丘脑功能障碍在普拉德-威利综合征(PWS)上表现很明显.[18]因此，NDN突变，以及在其他具有相同印记簇的基因，包括SNRPN和核仁小RNAs突变均与PWS有关.

3　印记基因对干细胞的作用

最近发现印记基因对干细胞具有至关重要的作用，相关研究涉及到胚胎干细胞(ESCs)、诱导性多功能干细胞(iPSCs)和成人干细胞.

不管这些细胞将来是否被用于研究基础发育过程或人类治疗，一个适当的印记标准是必不可少的.印记丢失(LOI)不仅可以导致前面提到的早期生长发育障碍，而且与细胞转化和癌症也高度相关.许多印记基因，包括H19、PEG1、PEG3是已知的肿瘤抑制基因.[19]此外，“imprint-free”小鼠ESCs具有完全的LOI，对于嵌合体发育产生明显的效果，这些老鼠在一年之后患有多种类型的癌症.[20]因此,对于iPSCs中印记基因的表达和功能需要仔细研究，这些研究结果以及对于胚胎干细胞和成体干细胞的印记分析，突出了多功能干细胞群中印记基因功能的重要性.

印记基因与成体干细胞群的维持和功能密切相关.父系PEG3表达转基因报告显示小鼠成体鼠的PEG3在各种组织中的干细胞群中表达受限，这些组织包括大脑、肠、骨骼、肌肉和皮肤.[21]神经球的生成，是通过体外神经元分离和扩增技术形成的，在此过程中导致了约100%的PEG3阳性细胞的生成.此外，表皮移植实验表明转移PEG3阳性细胞在毛囊干细胞壁龛中具有自我更新和分化能力.这些实验表明，PEG3在成体干细胞中起着功能性作用，虽然目前尚不清楚这些作用是否与早期发育中所体现出的作用不同.

在小鼠中，母系表达H19基因与成人造血干细胞（HSC）群的维持也有关.[22]诱导母系HSCs H19/IGF2 ICR删除，导致H19表达减少和IGF2表达增加，伴随着造血干细胞数目长期减少，短期增加，逐渐丧失造血潜能和功能.此外，母系H19/IGF2 ICR的删除通过增加IGF2表达量和降低IGF1R表达量导致IGF2-IGF1R通路的不适当的激活，而IGF1R又是mir-675的靶位点，这导致由FOXO3介导的细胞周期阻滞相关的静止受到抑制，最终导致活化以及长期HSCs耗尽.

此外，研究证实小鼠神经干细胞（NSCs）及其壁龛选择性丢失DLK1印迹对于后天神经形成至关重要.[23]DLK1是Notch信号的膜结合受体，出生后大多数组Notch信号下调.小鼠DLK1缺陷导致慢区分神经干细胞减少，从而导致成人嗅球神经元耗竭.神经干细胞和周围的星形胶质细胞从2个等位基因表达DLK1，而DLK1只从父系等位基因表达.DLK1这种协调双等位基因表达凸显了印记基因调控环境特异性的重要性，以及基因剂量对印记基因的重要性.

4　总结

虽然初期研究表明，印记基因的表达对早期胚胎生长和分化十分关键，特别是基因组印迹对哺乳动物的发育起着更广泛的作用.值得注意的是这一评述旨在强调的只是基因组印记和印记基因的部分功能，并不全面.许多印记基因的各项功能已被记载下来，但对组织特异性印记的理解还不够充分.对于印记在复杂的组织如大脑以及成人干细胞中作用的进一步探索无疑将为我们带来关于印记基因的表达及其功能的更多发现.

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