外泌体在中医证候研究中的应用※

焦海燕 严志祎 刘玥芸 姜幼明

（北京中医药大学中医学院，北京 100029）

中医证候的研究一直是现代中医学研究的重点，随着证候研究与多学科的交叉，以及新的研究方法和理念的引入，证候研究水平不断深化，研究层次也得到了拓宽。由于证候的复杂性、模糊性、动态性等特点，证候理论的客观化以及证候诊断标准与机制的研究仍是现阶段中医证候研究的重点内容。近年来，细胞分泌的胞外小囊泡在生物体内发挥的作用被逐步发掘，受到越来越多研究者们的关注。细胞外囊泡包括微泡 (microvesicle)、外泌体 (exosomes)、微球 (microparticle)以及凋亡小体 (apoptotic body)，这些成分各异的囊泡体均能介导细胞间的信息交换和物质传递，而外泌体是其中功能较为突出的一类小囊泡[1]。外泌体作为胞外活性囊泡体，能够参与细胞间的信号传递，其中所包含的大量活性物质参与机体各项生理活动，对相应组织细胞产生的外泌体进行研究能够从微环境的角度揭示细胞间通讯促进某一疾病发生的机制与物质基础。此外，外泌体中也包含了疾病状态下细胞的分子信息，因而含有丰富的生物标志物分子源，可用于疾病的诊断。因此，将外泌体引入中医证候的研究，能够有效拓展证候研究的思路，促进微观辨证的发展，为中医证候的客观化提供物质基础。

1 外泌体的生物学特征

外泌体于1987年首次发现于网织红细胞的培养液中，在之后的研究中发现神经细胞、成纤维细胞、淋巴细胞、白细胞、树突状细胞、肥大细胞、肿瘤细胞等多种细胞均能分泌和释放外泌体，使其广泛存在于外周血、组织、细胞间隙以及各种体液中[2]。随后，有研究发现B淋巴细胞释放的外泌体能够刺激T细胞活化、增殖，诱导免疫反应，改变细胞外微环境，从而抑制肿瘤细胞生长，这使研究者们认识到外泌体不仅是细胞的代谢产物，其在机体生命活动中也发挥着重要的作用[3]。

在作用机制方面，外泌体与微泡并没有太大的区分，它们均是为了细胞间的相互作用而被释放到胞外，包含细胞释放的核酸、蛋白、脂质等分子，在与受体细胞结合后介导胞内信号转导，改变受体细胞的功能。外泌体与微泡的主要区别在于形成方式不同，外泌体是由胞内内溶酶体微粒 (endolysosomal vesicle)形成的多囊泡体 (multi-vesicular body)与细胞膜融合后向胞外分泌的小囊泡，其大小均一，直径在40～150 nm，不同细胞释放的外泌体表面均有相似的保守蛋白标志物，如CD9、CD63、CD81、Alix等，与其来源细胞相关的特异性物质包含在囊泡内，使不同源的外泌体具有相应的生物学功能[4]，另外大量研究表明，各类进化保守蛋白对不同来源的外泌体的形成与释放具有一定的作用，如微管蛋白和肌动蛋白参与了外泌体的形成过程，磷脂酶D2影响外泌体的释放，HSP70有助于外泌体适应感染、缺氧、细胞因子刺激等不利的细胞外环境，同时也能使外泌体激活免疫系统消灭病变细胞，CD55与CD59则可以保护外泌体免受机体的免疫攻击[5]；微泡则是由细胞出芽后，与细胞膜融合直接脱落而形成的囊泡，大小不一，直径约在50 nm～1000 nm，目前研究尚未明确微泡是否具有表面标志蛋白，其膜脂质成分、蛋白组成等也还需进一步的探索[6]。

外泌体与靶细胞的识别具有特异性，其介导细胞信号传递的方式主要有以下四种[7]：一是直接作用于靶细胞表面的特异性受体，如T淋巴细胞源的外泌体可通过磷脂酰丝氨酸特异性识别单核细胞膜表面的受体，从而诱导胆固醇堆积，这一过程可被抗磷脂酰丝氨酸受体的抗体抑制[8]；二是被靶细胞摄入，释放生物活性物质发挥作用，如肿瘤细胞源的外泌体通过被自然杀伤细胞吸收，转移HSP70来激活自然杀伤细胞，促进机体的抗肿瘤功能[9]；三是细胞间受体转移，如人体血浆中外泌体中含有转录因子受体-PPARγ，具有调节免疫相关细胞与脂肪细胞基因表达的作用[10]，四是通过与受体细胞融合后释放mRNA、microRNA等传递遗传信息，如小鼠肥大细胞源的外泌体可被人的肥大细胞摄入，其携带的mRNA进入人细胞胞浆后能被翻译成蛋白[11]。常见的细胞间信息交流方式是通过细胞释放蛋白等信号分子来传递的，通过作用于靶细胞膜表面受体激活胞内信号通路，从而引起受体细胞功能状态的变化。外泌体与这些信号传递分子不同，是细胞间交流的特殊媒介[12]，其介导的细胞间信息交换确保了细胞信号分子体液弥散过程的顺利，保证了部分在细胞外环境中易失活或降解的活性成分能够顺利转移至靶细胞而发挥其功能。外泌体中运载的活性分子种类丰富，富含脂质、蛋白质、mRNA、microRNA等成分，可调控基因表达影响，影响蛋白的分布和修饰，其膜结构中含有跨膜蛋白PGRL、LAMP1、LAMP2以及有膜转运融合蛋白annexins、RAN、GTPases，膜上具有能绑定特异性肽链的MHC-1/2蛋白，且膜上的脂质筏Chol、ceramide、SM、PC等能限制膜流动，参与物质内吞、跨膜信号转导、脂质及蛋白定向分选等多种调节。外泌体通过信号通路、细胞自动调节以及关键酶反应等方式多途径、多靶点地对受体细胞功能活动进行调节，有效地提高了细胞间相互作用的精度和效率，更加符合机体生命活动的需要。因此，与外泌体产生相关的重要分子有Ral、ARF6、PLD2、RAB家族等，外泌体在体内广泛而稳定的分布，对机体包括内分泌调节在内的各项生命活动具有重要意义。

2 外泌体与证候研究的联系

外泌体具体发挥哪种效应机制是由其生理与病理状态所决定的，外泌体的成分能够反映释放细胞的功能，并且可能包含细胞病态相关的物质信息[13]，如在肝脏中，肝细胞的外泌体具有调节肝细胞增殖的作用[14]，巨噬细胞源的外泌体对肝脏炎症反应具有调节功能[15]，而肝星状细胞的外泌体参与了肝纤维化的形成过程[16]，在酒精肝的机理研究中发现，肝细胞能在乙醇激活的Caspase3依赖通路调控下，分泌含有CD40配体的外泌体，进而促进巨噬细胞活化，加重肝脏的炎症反应[17]；在外界刺激下，神经元通过释放信号提高少突胶质细胞内Ca2+通道的通透性，促进少突胶质细胞外泌体的释放[18]，少突胶质细胞的外泌体又能够增强神经元的活性，这一过程与Akt、Erk1/2激酶的调控密切相关[19]。在疾病的发生过程中，外泌体的结构和功能均发生相应变化，如在心肌梗死的炎症早期，中性粒细胞来源的外泌体可刺激生成IL-10而发挥抗炎作用，而在炎症晚期，纤维母细胞分泌的外泌体则会引起MCP-1、MMPs等促炎因子的升高[20]；在神经退行性疾病研究中发现，神经元与脑脊液中的外泌体中检测到含有丰富的蛋白质侵染因子，提示外泌体在退行性病变的发病中起到一定的作用[21]。外泌体在疾病发生发展中的作用日益被研究者们所重视，不同组织细胞来源的外泌体功能各异，影响着机体各个系统的功能活动与病理改变，并且外泌体的调控作用可能与一些发病机理尚不明确的疾病密切相关。

在证候的现代研究中，病证结合的研究思路具有非凡的指导意义[22]，病证结合是将中医证的概念与西医病的理论进行结合，加强了传统中医证候理论的科学属性，结合现代研究技术和方法，使证候更加客观化，使辨证论治更具科学性。外泌体作为如今各类疾病研究的热点，同样可以作为研究中医证候生物学基础的基石，以脑卒中为例，有研究表明当脑卒中发生时，成熟的少突胶质细胞在谷氨酸的作用下释放外泌体，外泌体中包含的Hsc/HSP70、H2O2、SOD-I等能在神经元的应激保护中起到一定的作用，将缺血损伤限制在局部范围[23]；而脑卒中的证候类型主要以风痰瘀阻证、阴虚风动证、风火上扰证为主[24]，因此，可以将脑卒中不同证候中少突胶质细胞释放的外泌体作为研究对象，以此探索脑卒中证候规律与发病机制的途径。在疾病与证候进行之时，机体的相应系统中发生着微观物质改变，同样也会引起相关细胞分泌外泌体的结构功能变化，将外泌体引入中医证候机制的研究中，以病证结合的思维作为桥梁，探索外泌体在证候发生过程中的变化，将有助于更全面地探索证候的生物机制。

3 外泌体与证候诊断的相关性分析

在机体内，不同细胞内包含的物质存在差异，其释放的外泌体内容物也会有相应的不同，不同生理病理状态下细胞分泌的外泌体也有不同。外泌体携带了特异的生物信息，介导疾病的进程，具有作为生物标志物的潜力[25]。因此，检测外泌体中特异的分子标志物，比较健康与疾病状态下外泌体中物质的差异在疾病诊断过程中具有广阔的应用前景[26]。血液与体液中的外泌体易于分离，稳定性较高，常用于疾病标志物的检测，如外周血提取的外泌体中的glypican-1+可用于胰腺癌的诊断，其特异性和敏感性优于传统诊断指标CA19-9[27]；外周血外泌体中miR-141的表达水平可用于前列腺肿瘤的良性与恶性鉴别[28]；肝星状细胞外泌体表面标志物CD81在慢性C型肝炎中的表达上调，这表明肝星状细胞外泌体中的CD81可以作为慢性C型肝炎的潜在诊断治疗标志物[29]；在急性肾损伤模型中，尿液来源的外泌体中胎球蛋白A含量增加了50倍，其含量变化比传统标记物肌苷酸发生得更早[30]；尿液来源外泌体中的ATF3和WT-1可能分别是急性肾小管损伤和慢性肾相关足突状细胞损伤的新型生物标记物，这一结论尚需大样本的临床验证[31]。

无论在生理还是病理状态下，细胞都能分泌相应的外泌体，其包含的物质能够代表细胞或系统的一定的生理病理状况，将外泌体的内容物作为一种生物标志物用于临床疾病诊断，与中医辨证论治中微观辨证的理念息息相关。微观辨证指明了证候标准化的研究方向，其发展离不开病证结合的科学思维，将研究发现的外泌体内容物中的疾病诊断标志物用于证候的诊断是研究的基本思路，能否在外泌体内容物中发掘出某一证候的诊断标志物也是研究的难点所在。外泌体虽然作为生物标记物的研究位点具有一定优势，但在研究中仍然需要谨慎对待。首先，外泌体数量庞大，种类繁多，但单个外泌体内容物含量较少，因此在考虑将外泌体作为生物标记物时需考虑内容物的有效丰度。其次，提取出的外泌体的纯度直接影响生物标记物的研究结果，外泌体的提取与鉴定尤为重要。最后，由于外泌体来源于各种类型的细胞，如果从血液、汗液、尿液等外泌体种类较多的体液中提取外泌体，则需要进行外泌体来源细胞的筛选。总之，在病证结合思维与微观辨证方法的指导下，将外泌体作为中医证候诊断的潜在靶点是很有意义的，但仍需要仔细深入的研究与探索。

4 展望

在机体的各种生理和病理过程中，外泌体从释放到与特定受体细胞结合传递信息，发挥了重要的调节作用，在病证结合的研究思路下，外泌体可作为证候机制研究的一条新途径；同时，深入探讨各类细胞释放的外泌体的结构和功能，能够为微观辨证和证候的诊断与标准化提供新的思路。此外，由于外泌体形态较小，易透过血脑屏障[32]，结合方证研究的相关思路，中药复方对外泌体的作用也可能成为证候研究的一个有效手段。总之，外泌体作为一个新的研究热点，如何使其与证候研究相契合，发挥出最大的潜力，需要中医药研究者们共同的探索与思考。

[1]Tetta C，Ghigo E，Silengo L，et al.Extracellular vesicles as an emerging mechanismofcell-to-cell communication[J].Endocrine，2013，44(1):11.

[2]Johnstone R M，Adam M，Hammond J R，et al.Vesicle formation during reticulocyte maturation.Association of plasma membrane activities with released vesicles (exosomes)[J].Journal of Biological Chemistry，1987，262(19):9412.

[3]Raposo G，Nijman HW，Stoorvogel W，et al.B lymphocytes secrete antigenpresenting vesicles[J].Journal of Experimental Medicine，1996，183(3):1161.

[4]SimpsonR，JensenSJ.Proteomicprofilingofexosomes:currentperspectives[J].Proteomics，2008，8(19):4083.

[5]吴金恩，丁军涛.外泌体生物学功能及应用研究进展[J].动物医学进展，2016，37(12):90-94.

[6]LeeY，ElAndaloussiS，WoodMJA.Exosomesand microvesicles:extracellularvesicles for genetic information transfer and gene therapy[J].Human MolecularGenetics，2012，21(R1):R125.

[7]Camussi G，Deregibus M C，Bruno S，et al.Exosomes/microvesicles as a mechanism of cell-to-cell communication[J].Kidney International，2010，78(9):838-848.

[8]Zakharova L，Svetlova M，Fomina A F.T cell exosomes induce cholesterol accumulation in human monocytes via phosphatidylserine receptor.J Cell Physiol[J].Journal ofCellular Physiology，2007，212(1):174.

[9]Lancaster G I，Febbraio M A.Exosome-dependent Trafficking of HSP70 A NOVELSECRETORYPATHWAYFOR CELLULAR STRESSPROTEINS[J].JournalofBiologicalChemistry，2005，280(24):23349.

[10]Looze C，Yui D，Leung L，et al.Proteomic profiling of human plasma exosomes identifies PPARgamma as an exosome-associated protein[J].Biochemical&Biophysical Research Communications，2009，378(3):433.

[11]ValadiH，EkströmK，BossiosA，etal.Exosome-mediated transfer ofmRNAs andmicroRNAsisanovelmechanismofgeneticexchangebetweencells[J].Nature Cell Biology，2007，9(6):654-659.

[12]Sun D，Zhuang X，Zhang S，et al.Exosomes are endogenous nanoparticles that can deliver biological information between cells[J].Advanced DrugDeliveryReviews，2013，65(3):342-347.

[13]Mathivanan S，Lim J W E，Tauro B J，et al.Proteomics analysis of A33 immunoaffinity-purified exosomes released from the human colon tumor cell line LIM1215 reveals a tissue-specific protein signature[J].Molecular&Cellular Proteomics Mcp，2010，9(2):197.

[14]Nojima H，Freeman CM，Schuster R M，et al.Hepatocyte exosomes mediate liver repair and regeneration via sphingosine-1-phosphate[J].Journal ofHepatology，2016，64(1):60.

[15]Saha B，Momenheravi F，Kodys K，et al.MicroRNA Cargo of Extracellular Vesicles fromAlcohol-exposed Monocytes Signals Naive Monocytes to DifferentiateintoM2Macrophages[J].JournalofBiologicalChemistry，2016，291(1):149.

[16]Chen L，Chen R，Kemper S，et al.Suppression of fibrogenic signaling in hepatic stellate cells byTwist1-dependent microRNA-214 expression:Role of exosomesinhorizontaltransferofTwist1[J].AmericanJournalofPhysiologyGastrointestinal&LiverPhysiology，2015，309(6):G491.

[17]Verma VK，Li H，WangR，et al.Alcohol stimulates macrophage activation through caspase dependent hepatocyte derived release of CD40L containing extracellular vesicles[J].Journal ofHepatology，2016，64(3):651.

[18]Carsten F，Dominik F，Eva-Maria K A.Emerging Roles of Exosomes in Neuron Glia Communication[J].Frontiers in Physiology，2012，3(3):119.

[19]Jin K，MaoXO，Zhu Y，et al.MEKand ERKprotect hypoxic cortical neuronsviaphosphorylationofBad[J].JournalofNeurochemistry，2002，80(1):119.

[20]Distler J H W，PisetskyDS，Huber LC，et al.Microparticles as regulators of inflammation:Novel players of cellular crosstalk in the rheumatic diseases[J].Arthritis&Rheumatism，2005，52(11):3337-3348.

[21]Berrone E，Corona C，Mazza M，et al.Detection of cellular prion protein in exosomes，derived from ovine plasma[J].Journal of General Virology，2015，96(12):3698.

[22]李柳骥，陈家旭.试述中医病证结合的关系[J].北京中医药大学学报，2004，27(3):7-9.

[23]Frühbeis C，Fröhlich D，Wen P K，et al.Neurotransmitter-Triggered Transfer of Exosomes Mediates Oligodendrocyte Neuron Communication[J].PLoSBiology，2013，11(7):e1001604.

[24]陈光艳.缺血性脑卒中患者中医体质、中医证候类型、5-HT、NE与脑卒中后抑郁发病的关系研究[D].济南：山东中医药大学，2014.

[25]覃思华，郑磊.外泌体蛋白质组学研究进展[J].临床检验杂志，2016，34(12):927-930.

[26]朱伟，李雅红.Exosomes(外体)在临床诊断和治疗中的应用[J].临床检验杂志，2012，30(10):846-849.

[27]Melo S A，Luecke L B，Kahlert C，et al.Glypican-1 identifies cancer exosomes and detects early pancreatic cancer[J].Nature，2015，523(7559):177.

[28]ThéryC，Duban L，Segura E，et al.Indirect activation ofnaïve CD4+Tcells bydendritic cell-derived exosomes[J].Nature Immunology，2002，3(12):1156-1162.

[29]Welker MW，Reichert D，Süsser S，et al.876 Soluble SerumCD81 is Elevated in Patients with Chronic Hepatitis C and Correlates with Alanine Aminotransferase SerumActivity[J].Plos One，2012，7(2):S341-S341.

[30]Zhou H，Pisitkun T，Aponte A，et al.Exosomal Fetuin-A identified byproteomics:a novel urinary biomarker for detecting acute kidney injury.[J].Kidney International，2006，70(10):1847-1857.

[31]Zhou H，CheruvankyA，Hu X，et al.Urinaryexosomal transcription factors，a newclass ofbiomarkers for renal disease[J].KidneyInternational，2008，74(5):613-621.

[32]SquadritoML，BaerC，BurdetF，etal.EndogenousRNAsmodulatemicroRNAsortingtoexosomesandtransfertoacceptorcells[J].CellReports，2014，8(5):1432.