中老年慢性乙型肝炎合并肝脂肪变患者肝脏病理表现及抗病毒疗效的影响因素

吴卫锋 盖晓东

(南京市第二医院，江苏 南京 210003)

我国是慢性乙型肝炎(乙肝)高感染国家〔1〕，调查研究显示，30%～50%的慢性乙肝患者合并肝脂肪变，其中以中老年人群为主〔2〕。目前关于慢性乙肝与肝脂肪变相互关系的研究多集中在流行病学资料，对合并肝脂肪变是否影响慢性乙肝抗病毒应答的结论尚未一致〔3，4〕。本次研究拟探讨合并肝脂肪变对慢性乙肝患者抗病毒疗效的影响及可能机制。

1 对象与方法

1.1研究对象 选取2012年6月至2016年10月在南京市第二医院确诊为慢性乙肝的中老年患者90例，将其中合并肝脂肪变37例为肝脂肪变组，单纯慢性乙肝53例为无肝脂肪变组。入选标准：①乙肝表面抗原(HBsAg)阳性持续时间>6个月，血清乙肝病毒(HBV)-DNA阳性；②肝组织活检确诊为慢性乙肝但不限制是否合并肝脂肪变；③未接受抗病毒治疗。排除标准：①合并其他类型肝炎病毒感染；②存在酒精肝、药源性肝病、自身免疫性肝病等其他肝脏损伤因素者；③合并糖尿病，肝肾等重要器官功能障碍者。本研究经医院伦理委员会批准，患者知情同意。收集活检时两组患者肝组织标本，10%甲醛溶液固定后用于本实验。

1.2主要试剂 氢氧化银氨液、硫酸铁铵溶液购于北京百奥莱博科技有限公司；内源性过氧化物酶阻断剂、山羊血清、二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒购于赫澎(上海)生物科技有限公司；兔抗人乙肝核心抗原(HBcAg)单克隆抗体、兔抗人HBcAg单克隆抗体、生物素标记的羊抗兔免疫球蛋白(Ig)G抗体购于上海麦仓生物科技有限公司。

1.3方法

1.3.1苏木素-伊红(HE)染色观察肝组织炎症分级 取固定后的肝组织标本常规梯度乙醇脱水、二甲苯透明、石蜡包埋，切片机4 μm连续切片后置于纯水中，干净的载玻片捞起后放入70℃烘箱中1 h。常规脱蜡、透明后行HE染色，中性树胶封固，光学显微镜下观察肝组织炎症分级。

1.3.2氢氧化银氨液浸染法观察肝组织纤维化情况 切片脱蜡后，放入酸性高锰酸钾溶液氧化3 min，蒸馏水冲洗；放入2%硫酸铁铵溶液10 min，蒸馏水冲洗；向每张切片上滴加氢氧化银氨溶液反应10 min，蒸馏水冲洗后用20%甲醛溶液还原3 min，脱水、透明、中性树胶封固。

1.3.3免疫组化检测HBsAg、HBcAg表达情况 切片脱蜡后用磷酸缓冲液洗涤，每张切片上滴加100 μl过氧化物阻断剂，室温下静置20 min，冲洗后滴加100 μl山羊血清，室温下静置20 min，冲洗后滴加兔抗人HBsAg、HBcAg单克隆抗体(1∶100稀释)，37℃孵育2 h，滴加生物素标记的羊抗兔IgG抗体(1∶500稀释)，-4℃冷藏过夜，DAB显色、苏木精复染、中性树胶封固，倒置显微镜下观察并拍照。

1.4统计学分析 采用SPSS20.0软件，计量资料组间比较进行t检验，计数资料行χ2检验。

2 结 果

2.1两组肝活检前生化、血清、病毒学指标比较 肝脂肪变组谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、总胆红素(TB)、直接胆红素(DB)、高密度脂蛋白(HDL)、载脂蛋白(Apo)a水平明显低于无肝脂肪变组(P<0.05)；肝脂肪变组低密度脂蛋白(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白(LDL)、Apob、尿酸(UA)水平明显高于无肝脂肪变组(P<0.05)；两组白蛋白(ALB)、空腹血糖(FBG)、HBV-DNA载量、乙肝e抗原(HBeAg)阳性率之间差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 两组肝活检前生化、血清、病毒学指标比较

2.2两组炎症和纤维化程度比较 肝脂肪变组炎症和纤维化程度明显低于无肝脂肪变组，中重度以上炎症和纤维化程度比例明显低于无肝脂肪变组(P<0.01)。见表2，图1，图2。

2.3两组HBsAg、HBcAg表达强度和面积比较 HBsAg多表达于胞质、浆膜内，分为浆膜型、胞质型，部分伴有包涵体型，单纯胞膜上表达较少；HBcAg表达包括阴性、胞质型、胞核型、浆核型，以浆核型为主(见图3)。将阳性细胞表达强度和面积均分别合并为1～2级(+～)、3～4级(～)以方便统计比较。结果显示，肝脂肪变组HBsAg、HBcAg表达强度3～4级及表达面积3～4级的比例均明显低于无肝脂肪变组(P<0.01)。见表3，图3。

表2 两组炎症和纤维化程度比较〔n(%)〕

表3 两组HBsAg、HBcAg表达强度和面积比较〔n(%)〕

与无肝脂肪变组比较：1)P<0.01

A：炎症轻微，汇管区可见少量浸润及分散的小泡性脂肪细胞；B：界面炎症，汇管区可见炎性浸润；C：肝细胞气球样病变，汇管区可见大量炎性浸润；D：肝细胞坏死，汇管区大量炎性浸润图1 两组不同炎症程度炎症细胞浸润情况(HE，×100)

A：汇管区纤维沉积，血窦周围少量纤维化；B：汇管区和血窦轻微纤维化；C：汇管区芒状纤维沉积，血窦周围少量胶原纤维沉积；D：汇管区少量芒状纤维沉积图2 两组不同纤维化程度(氢氧化银氨液浸染法染色，×100)

A：HBsAg在肝脂肪变组细胞中浆膜型表达(×200)；B：HBcAg在肝脂肪变组细胞中浆核型表达(×200)；C：无肝脂肪变组HBsAg反应强于肝脂肪变组(×100)；D：肝脂肪变组HBcAg反应强度和面积下降(×100)图3 免疫组化检测HBsAg、HBcAg在肝组织中的表达情况

3 讨 论

相关研究显示，慢性乙肝合并肝脂肪变患者干扰素治疗的效果偏低〔5〕，但影响机制尚未明确。有研究者认为，该影响可能与肝细胞中脂肪堆积影响了正常细胞形态，造成干扰素与细胞膜接触面积减少有关〔6〕。本次研究提示慢性乙肝患者出现肝脂肪变主要与宿主代谢异常有关，而且合并肝脂肪变患者肝损伤程度低于未合并者。

HBsAg、HBcAg在肝组织中表达与肝细胞损害程度密切相关〔7〕。本次研究中无论慢性乙肝患者是否合并肝脂肪变，肝细胞中HBsAg、HBcAg均主要分布于浆膜、浆核中，两组抗病毒蛋白在肝细胞中的分布情况无明显差异，提示肝脂肪细胞不影响乙肝病毒蛋白在肝组织中的分布位置。但HBsAg、HBcAg的表达强度和面积受脂肪细胞影响，提示脂肪的存在能够减弱乙肝病毒蛋白在肝细胞中的表达。相关研究显示，HBV进入人体血液循环后最先感染肝细胞，在胞质中分泌HBsAg、HBcAg等病毒抗原，当累积到一定数量后可诱发特异性免疫应答，攻击被感染的肝细胞〔8〕。因此可推测，在是否合并肝脂肪变抗原表达方式无明显差异的前提下，合并肝脂肪变可明显减弱HBsAg、HBcAg在肝细胞中的表达水平，同时减弱了病毒蛋白激活免疫应答的能力，进而减少了肝细胞被攻击程度，在炎症反应较轻的同时也减弱了干扰素的抗病毒疗效。今后的研究中可从免疫水平和病毒DNA水平进一步验证以上观点。

1孙 云.2015年3月-2016年3月临沧市乙型病毒性肝炎流行特征及防控进展〔J〕.中国卫生工程学，2017；16(1)：91-2.

2赵 帅，孙静娜，代丽丽，等.老年慢性乙型肝炎患者用药治疗后乙肝病毒耐药基因多位点变异〔J〕.中国老年学杂志，2017；37(10)：2484-5.

3张 琨.慢性HBV感染者外周血单个核细胞凋亡相关因子的表达和乙肝慢性化关系〔D〕.济南：山东大学，2016.

4刘 莹.乙肝转阴散在恩替卡韦分散片治疗乙型肝炎肝硬化过程中的作用及其机制研究〔D〕.南宁：广西中医药大学，2016.

5倪红霞，刘楠楠，姜 晶，等.慢性肝病肝穿活检组织病理学研究〔J〕.北华大学学报(自然科学版)，2017；18(2)：197-200.

6喻慧铭，盛吉芳.e 抗原阴性慢性乙肝老年患者核苷类药物停药后的临床和病毒学复发评估〔J〕.中国老年学杂志，2016；36(6)：1393-5.

7边瑞岩.2005～2014年滨州市乙型病毒性肝炎流行特征分析〔J〕.中国卫生工程学，2016；15(3)：275-6.

8郝 锐.恩替卡韦治疗慢性乙型肝炎肝纤维化的临床观察〔J〕.北华大学学报(自然科学版)，2014；(5)：630-2.