荆半夏组织培养及快速繁殖研究

饶茜茜，段思，叶子荣，王玉杰 刘秀秀，张建，赵振军

(长江大学园艺园林学院，湖北 荆州 434025)

半夏(PinelliaTernata(Thunb.)Breit.)又名老鸦芋头、野芋头、地巴豆等，是天南星科半夏属的一种多年生植物，其块茎入药，具有润燥化痰、降逆止呕等功效[1]，是一类需求量非常大的中药。半夏分布面积广，除内蒙古、吉林、黑龙江、青海、新疆、西藏外，其他各省区均有分布，以四川、贵州、云南、甘肃、湖北、山东、安徽资源较多[2]。“荆半夏”(因产于湖北荆州地区而得名)具有品质佳、质量优等特点，是半夏中的佳品，深受各地药商的青睐，在全国半夏产品中一直属于紧俏药材。随着近年来对荆半夏的需求量不断增加，野生资源进一步枯竭。通过大力推广人工栽培，并探索行之有效的快速繁殖技术，可在解决其由于资源短缺制约半夏产业可持续发展的同时，实现对荆半夏品种资源的优化与快速利用。

荆半夏种子结实率、萌芽率低，常以块茎繁殖为主，但块茎繁殖系数低，而且耗种量大，难以进行大规模商业生产。目前，已对半夏叶片、叶柄、珠芽等外植体愈伤组织的诱导与分化特征进行了研究[3～10]，在半夏、荆半夏组织培养关键技术的探索上取得了一定的进展，但是还没有荆半夏组织培养技术迅速推广应用的报道。因此，本研究在前人的基础上，以荆半夏的叶片、叶柄、珠芽、块茎作为外植体，设计了不同激素配比的培养基，对荆半夏进行了离体培养及快繁技术的研究，旨在建立一套简单实用且易推广的荆半夏组培快繁技术体系，为荆半夏产业化发展提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料

精选优质野生荆半夏，取其叶片、叶柄、珠芽、块茎为外植体。

1.2 试验方法

1.2.1 外植体灭菌

选择完整的半夏植株，取其叶片、叶柄、珠芽、块茎作为外植体，自来水冲洗干净。于超净工作台中用75%的乙醇浸泡30s，然后用无菌水冲洗3～5遍，再置于0.1%升汞溶液中消毒15min，期间不断摇动，取出后用无菌水再冲洗 3～5遍。将外植体置于三角瓶中备用。

1.2.2 培养基配置

基本培养基为MS，设计5种不同的激素配比：①MS+6-BA (6-苄氨基腺嘌呤) 1.0mg/L+NAA (萘乙酸)1.0mg/L；②MS+6-BA 2.0mg/L+NAA 0.5mg/L；③MS+6-BA 2.0mg/L+NAA 1.0mg/L；④MS+6-BA 3.0mg/L+NAA 0.5mg/L；⑤MS+NAA 0.5mg/L。以上培养基其他条件均为：pH 5.8，琼脂7.0 g/L，蔗糖3%。

1.2.3 接种与培养

在超净工作台中将消毒好的材料置于无菌滤纸上晾干后，将叶片切成0.1cm×0.1cm、叶柄切成2.0cm、块茎和珠芽切成0.5cm3，分别接种在上述①～④号培养基中。接种方式：叶片背面接触培养基，叶柄横向放置，珠芽和块茎水平置于培养基。

培养条件：温度25℃，光照强度1500～2000lx,光照时间12h。

1.2.4 生根培养

当叶片、叶柄、珠芽、块茎形成的小苗长到5～8cm 长时分别转接到⑤号培养基中培养，7d后长出大量根系。

1.2.5 炼苗和移栽驯化

当幼苗长出3～4片叶,根长3～5cm左右时,开始炼苗：第1d将培养瓶盖半打开，于温室内炼苗,3d后将培养瓶盖全打开，炼苗5d后将苗取出,用清水洗净根部的琼脂,种植与营养土中，置于恒温培养箱中培养。

营养土配比：蛭石∶泥炭∶珍珠岩=1∶1∶1。

培养条件：温度22～25℃；湿度85%。当培养箱中的小苗适应培养环境并正常生长后将小苗移至大田栽培。

2 结果与分析

2.1 不同激素配比对叶片愈伤组织的诱导效果

接种8d后②号培养基叶片突起，边缘处形成少量白色愈伤组织；20d后形成大量浅绿色愈伤组织；30d后愈伤组织上开始分化出绿色突起小珠芽；40d后每个愈伤组织上形成2～3个珠芽；50d后生成丛生芽。接种在其他3种培养基中的叶片生长均较慢，且最终生成的小苗也比②号少(表1)。其中③号培养基中的叶片20d后才开始形成少量愈伤组织，可能是由于NAA浓度过高，抑制愈伤组织的形成，故②号培养基最适合叶片愈伤组织的形成和芽的分化。

表1 不同激素配比下的半夏叶片愈伤组织的诱导率和芽分化率

2.2 不同激素配比对叶柄愈伤组织的诱导效果

接种9d后②号培养基叶柄两端卷起，伤口处出现膨大；25d后形成大量白色愈伤组织；35d后愈伤组织上开始分化出绿色绿色突起小珠芽； 40d后每个愈伤组织上形成3～5个珠芽；50d后生成丛生芽(表2)。接种在其他3种培养基中的叶柄与②号培养基叶柄膨大时间一致，但愈伤组织形成时间均比②号培养基慢，且成苗率也较低，故②号培养基最适合叶柄愈伤组织的形成和芽的分化。

表2 不同激素配比下的半夏叶柄愈伤组织诱导率和芽分化率

2.3 不同激素配比对珠芽愈伤组织的诱导效果

接种5d后①号培养基中珠芽与培养基接触面形成少量颗粒状白色愈伤组织；15d后整个珠芽表面长满白色愈伤组织，25d后愈伤组织开始分化出小珠芽；35d后每个愈伤组织上形成6～9个珠芽；45d后生成大量丛生芽，同时珠芽基部开始生根(表3)。接种在其他3种培养基中的半夏珠芽愈伤组织和芽分化时间均较长，且愈伤诱导率和芽分化率都不高，故珠芽的最适培养基为①号培养基。

表3 不同激素配比下的半夏珠芽愈伤组织诱导率和芽分化率

2.4 不同激素配比对块茎愈伤组织的诱导效果

接种6d后①号培养基中块茎与培养基接触面形成少量颗粒状白色愈伤组织，20d后形成大量愈伤组织；30d后愈伤组织开始分化出小珠芽；40d后生成大量丛生芽，同时块茎基部开始生根。其他3种培养基中块茎愈伤组织诱导率均低于①号培养基，且分化时间较长，分化率也不高，故块茎的最适培养基为①号培养基(表4)。①号培养基中一个外植体最终形成的小苗数最高达20个，且炼苗移栽后还有分化出小苗的趋势。

表4 不同激素配比下的半夏块茎愈伤组织诱导率和芽分化率

2.5 同一培养基不同外植体生长比较

从图1可以看出，①号培养基块茎诱导出13个小苗，珠芽诱导出7个小苗，叶柄诱导出4个小苗，叶片诱导出3个小苗，说明4种不同外植体均能在①号培养基中诱导出荆半夏小苗。块茎、珠芽在①号培养基中的诱导个数明显高于叶柄和珠芽，说明①号培养基适合以块茎和珠芽为外植体快速繁殖小苗，与前述观察结果一致。

图1 ①号培养基下4种外植体生长情况

图2 不同外植体移栽情况(移栽20d后)

2.6 组织培养苗移栽效果

将块茎、珠芽、叶柄、叶片分化出的荆半夏小苗移栽到同一基质中，20d后将不同外植体培养出的荆半夏植株进行对比。由图2可知，块茎诱导出的植株株高15.0cm，根长4.0cm，生根数20根；珠芽诱导出的植株株高13.0cm，根长1.5cm，生根数7根；叶柄诱导出的植株株高15.0cm，根长4.0cm，生根数6根；叶片诱导出的植株株高9.5cm，根长4.0cm，生根数8根。说明在同一基质的培养下块茎诱导出的植株适应大田栽培环境的能力最强，叶柄、珠芽诱导出的植株次之，叶片诱导出的植株最弱。而且在栽培过程中发现叶片诱导出的荆半夏植株不易存活，生长力弱，故叶片诱导出的植株不适合大田栽培。

3 讨论与结论

本研究以荆半夏的叶片、叶柄、珠芽、块茎作为外植体，对荆半夏进行了组织培养研究。结果表明，在同样的激素配比条件下，珠芽、块茎的诱导率及分化率显著高于叶片和叶柄，其中块茎的诱导率和分化率最高，达到95%，说明珠芽、块茎比叶片、叶柄的分化能力强，这与顾明化[11]的结论一致。

在研究过程中发现，接种在MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 1.0mg/L培养基中的珠芽和块茎在分化的过程中伴随着生根过程，不需要转接到MS+NAA 0.5mg/L生根培养基中就可以分化成带根小苗，且在炼苗移栽后MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 1.0mg/L培养基中是珠芽和块茎还会继续分化出小苗，即达到了快速繁殖的目的也缩短了半夏的繁育周期，说明MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 1.0mg/L培养基最适合珠芽和块茎培养，可应用于生产实践。

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典(2005 年版一部)[M].北京：化学工业出版社,2005:78.

[2]张晓伟,王小峰,张应翠.半夏研究概况[J].现代中药研究与实践,2006,20(6):57～61.

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[4]朱鹏飞,毛文岳,王殿久,等.三叶半夏组织培养获得再生植株[J].植物生理学通讯,1985,(3):26.

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[9]李先良,王学民.荆半夏叶柄外植体快繁技术研究[J].安徽农业科学,2008,36(6):2247～ 2248.

[10]王学民.荆半夏叶片外植体快繁技术研究[J].荆门职业技术学院学报,2007,(12):1～4.

[11]顾明化.半夏组织培养研究进展[J].科学信息,2008,(23):358～359.

[编辑] 余文斌