动物类中药鉴定技术研究进展

许 燕 肖洪贺 段双蕊 谢 明

（辽宁中医药大学药学院，辽宁 大连 116600）

动物类中药应用历史悠久，早在中医经典著作《黄帝内经》和《伤寒论》中就记载了使用乌蜊骨、水蛭、牡蛎等动物药组方治病的例子。现存最早的药物学专著《神农本草经》中则收载有白僵蚕、羚羊角、麝香等67种动物药，占药物总量的18.36%，《唐本草》和《本草纲目》中分别收载动物药128种、461种；而当代《中华本草》和《动物本草》中收载的动物药更是高达1051种和1731种[1]。2015版《中国药典》收载51味动物药药材，含动物药的成方制剂461味，占成方制剂和单味制剂总量的30.9%[2]。由此可见，动物类中药一直备受医药学家和政府部门的重视，是中医药学遗产中的重要组成部分。同时，由于动物药富含蛋白质等生物信息大分子物质，这一性质与植物药富含次生代谢产物有着很大的区别，也极大增加鉴定研究的难度，从总体上来说动物药鉴定的研究相对薄弱但其对保证动物药品质量尤为重要[3]。本文将近些年来动物类中药鉴定方法的内容和应用做一简要综述，以期为动物类中药的规范化质量控制提供新的思路。

1 传统鉴定方法

常见动物药的传统鉴定方法主要有性状鉴定、显微鉴定以及理化鉴定。传统鉴定方法不依赖于现代化仪器设备，具有简单快捷等诸多优势，尤其是具有丰富经验的老药工们，能够做到“辨状论质”，所以传统鉴别方法依然是快速甄别药材真伪优劣的有力手段，特别是在野外或缺乏仪器的实验室贫困地区等[4]。

1.1 性状鉴定 性状鉴定是识别药材最基本、运用最广泛的方法，利用感官从动物药的表面特征（形状、颜色、纹路、突起、裂缝、附属物等），到药材断面特征（颜色、纹理等）、质地（光滑、粗糙、角质性等），注意找出具有专属性的性状特征。其具有简单明了的特点。目前大部分动物药仍采用这种方法。譬如：海马外形为“马头蛇尾瓦楞身”；羚羊角角弯中深锐紧小，有挂痕者为真，角内有“骨塞”“通天眼”[5]；牛黄表面有“乌金衣”；蕲蛇有“翘鼻头”“方胜纹”等特征[6]。近年来，随着动物分类学和动物解剖学的发展，传统性状鉴别正在从经验化、通俗化向规范化、科学化方向发展[7]。

1.2 显微鉴定 显微鉴定是指用解剖学的方法在显微镜下观察细胞形态、组织构造、细胞内含物等，在植物类药材中应用较早且广泛。由于动物药材组成复杂，显微鉴定的应用受到一定的影响和限制，起步较晚，发展较慢[8]。近年来，随着显微鉴定技术在动物药鉴定中的发展，尽管动物类中药没有植物药那么多的鉴别特征，但大部分动物类中药也可通过显微鉴定加以区别。

康廷国等[9]通过观察动物药残留毛显微特征，分析残留毛一系列特征性参数，成功鉴别了狗鞭、驴鞭、牛鞭、貂鞭、干家雀五种动物药材。苑冬敏等[10]利用蝉蜕、黑蚱、蟪蛄、焰螓蝉、金蝉衣的残留毛显微特征差异对蝉蜕的真伪进行了鉴别。邵燕等[11]对鼠妇虫、虫和蜣螂虫的刚毛及体壁碎片特征进行了显微鉴别，为鳖甲煎丸的质量控制提供了科学依据。

1.3 理化鉴定 理化鉴别是针对中药所含主要化学成分或有效成分，采用物理或化学方法进行鉴别，一般用于性状相似又无明显显微鉴别特征且化学成分不同的药材[12]。一般的理化鉴定方法都适用于动物药材，包括常规理化检查、光谱法、色谱法。

1.3.1 常规理化检查 蜂蜜的常规理化检查中，可测定其相对密度；蜂蜡和虫白蜡等可测定其熔点、溶解度或酸值、皂化值等物理常数，以控制其质量[13]。刘惠娟等[14]发现，正品燕窝于365 nm灯下显微蓝白色，而燕窝丝、燕窝球等加工品多显绿白色、蓝紫色或灰绿色。显微化学反应中燕窝的各种加工品及常见掺伪品对茚三酮、稀盐酸、碘、溴、麝香草酚蓝及碱性酒石酸铜的反应均与正品燕窝与之反应所得结果存在不同程度的差异。张贵均等[15]发现熊胆中的菜胆在紫外灯下呈现玻璃样光泽的黄白色荧光，而金胆、人工引流熊胆皆呈淡金黄色荧光。魏越[16]基于透光率测定的梅花鹿茸结果表明透光率可作为梅花鹿茸各规格、等级饮片鉴别的依据。

1.3.2 光谱法 光谱法是一种较为先进的鉴定方法，主要是以其中药成分中具有的“指纹”性特征为依据，对药物进行鉴定[17]。光谱分析操作简便、使用快捷、鉴定准确，对中药材样品的取量和破坏也相对较小，同时能够最大化地重现药材特性，提供更多的信息内容，很大程度上弥补了传统中药鉴定的不足，逐渐成为主要的常用鉴定手段之一[18]。常见的鉴定动物类中药的光谱法有紫外光谱法、红外光谱法、近红外光谱法以及X射线衍射法。

1.3.2.1 紫外光谱法 王喜军等[19]利用紫外光谱获得熊胆，猪胆，狗胆和羊胆汁的特征吸收，快速准确地对胆汁类药材作出鉴别。董玉秀等[20]利用紫外光谱法鉴别了4个不同产地的10批鳖甲药材，发现尽管吸收强度不同，但10批鳖甲在紫外区均有2个最大吸收峰，光谱鉴别法可作为本品的质量控制指标之一。

紫外光谱的敏感度很高，对药材的纯度和杂质鉴别效果显著，但紫外光谱对相似度极高的中药会出现吸收相似的现象使得鉴别不准确；而红外光谱法制样简单，鉴别准确[21]。

1.3.2.2 红外光谱法 Cho等[22]试验证明，可以通过红外光谱技术确定鹿茸的原产地，这为评估鹿茸质量提供了依据。赵丽茹[23]通过红外光谱分析技术，建立了哈蟆油的红外特征光谱，为哈蟆油的质量控制提供了一定的依据。冀宪领等[24]采用红外光谱法得到僵蚕和健康蚕醇溶部位的红外指纹图谱，两者指纹图谱明显不同；并且不同品种和季节的僵蚕红外指纹图谱也存在一定的差异。因此，用僵蚕醇溶部位的红外指纹图谱鉴别僵蚕，区别出不同品种和季节的僵蚕。

1.3.2.3 近红外光谱法 近红外光谱法是近年来发展较迅速的一种快速分析技术，有着光谱材料获取速度快、样品无需复杂预处理、对药材破坏小且使用化学试剂少、操作简便、成本低等优点，在动物药鉴定领域有着广泛应用。

魏道智等[25]应用傅立叶变换近红外光谱仪对蝼蛄的不同种和异地的同一种以及混乱品种进行鉴别。结果表明近红外分析法可应用于蝼蛄种的分类以及蝼蛄药材的鉴定。杨文哲等[26]以《中国药典》收载的5种海洋贝壳类中药饮片为研究对象，采用近红外光谱技术和主成分分析法研究该类饮片的鉴别。结果表明，该法能很好地区分牡蛎、石决明、珍珠母。

1.3.2.4 X射线衍射法 X射线衍射法是利用各药材的相组成、成分各不相同，被X射线照射而产生不同程度的衍射现象，产生特有的衍射图谱进而对中药进行鉴定的方法[27]。

翁立明等[28]用X射线衍射Fourier图谱分析技术对不同产地的10个全蝎样品进行分析研究。结果表明，9个样品衍射图谱的几何拓扑图形基本一致，说明X射线衍射Fourier指纹图谱鉴定法可用于动物中药材全蝎样品的分析鉴定和质量控制。王树春等[29]采用X衍射Fourier谱对4个花鹿茸样品进行分析，它们的衍射图形的几何拓扑特征相同，可取它们共有的10个峰为花鹿茸的特征标记峰，以作为识别花鹿茸的依据。又用本法识别比较熊胆与伪品、天然熊胆与引流熊胆干燥品，结果引流熊胆与天然熊胆X射线衍射Fourier图谱有一定的参考价值，且X射线衍射Fourier图谱能识别熊胆伪品，是一种快速、简便易行的物理鉴定方法，可作为熊胆质量控制手段之一。

1.3.3 色谱法 色谱鉴定法包括薄层色谱法、气相色谱法、液相色谱法。也可以几种方法联用技术对中药进行鉴别[17]。

1.3.3.1 薄层色谱法 薄层色谱法（TLC）操作简单、快速、经济、可靠，且可同时鉴别多个样品，独具特色。

张贵均等[15]应用新的展开剂对14种市售熊胆进行薄层鉴定，展开效果良好，可用于熊胆的真伪鉴别。张小兰[30]通过薄层色谱法对哈蟆油样品进行研究，建立了哈蟆油的TLC指纹图谱，能够有效地监测哈蟆油的质量，作为其质量控制的手段，为名贵动物药哈蟆油的开发和利用奠定了基础。

1.3.3.2 气相色谱法 气相色谱法已广泛应用于中药材及中成药挥发性成分分析，在动物类中药的鉴定中也有一定的应用。

张皓冰[31]采用气相色谱-质谱联用法，利用NIST标准谱库检索及结构分析确定了19种甾体成分结构，并提出了辨别麝香真伪的特征方法。王兆基等[32]利用气相色谱分析测定药材中斑蝥素成份，研究发现青娘子与斑蝥一样含有斑蝥素但含量很低，而红娘子不含斑蝥素。

1.3.3.3 液相色谱法 HPLC指纹图谱仪器分析法具有很好的精密性、稳定性及专属性，应用广泛。

黄玉明等[33]建立了蛤蟆油HPLC指纹图谱，并对蛤蟆油真伪及质量进行鉴定，结果可知这种方法可以有效检测出蛤蟆油质量，为蛤蟆油等动物类中药的临床应用、中药科科研等提供有利条件，为蛤蟆油等动物类中药的深入开发利用奠定基础。丁兴红[34]运用HPLC测定了蕲蛇药材中黄嘌呤、尿嘧啶、尿苷和次黄嘌呤的含量，结果表明通过测定蕲蛇中尿嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤和尿苷含量可以控制蕲蛇质量。陈申如等[35]精确测定牡蛎提取物中的牛磺酸含量，采用高效液相色谱法测定牡蛎中牛磺酸含量，该方法专属性好，灵敏度高。

1.3.4 高效毛细管电泳法 高效毛细管电泳（HPCE）是近年发展起来的新技术，具有高效、快速、样本体积小和分析范围广阔等优点。由于动物类药材含有大量蛋白质及其水解产物，因此应用电泳技术对动物类药材进行鉴定是行之有效的。

张朝晖等[36]对12种海马、海龙类药材采用HPCE进行鉴别研究，结果表明：该方法速度快、分辨力强、重现性好，为海龙、海马类药材的鉴别提供了一定的参考价值，也为动物类药材的鉴别提供了新的分析手段。此后，陈振德等[37]应用HPCE对中药穿山甲及其炮制品蛋白多肽进行分析，结果显示穿山甲与穿山甲炮制品的酸性提取液HPCE图谱有一定差异，可有效地加以区分。刘兴国等[38]用HPCE对蚂蝗及其混淆品菲牛蛭进行了鉴别，得出结论HPCE可快速准确地鉴别蚂蝗和菲牛蛭。

由于动物药化学成分的种类及含量高低与动物生境、采收季节、贮藏时间等诸多因素有关，故任何一种动物药的理化鉴别均应把常用的理化方法结合起来进行综合分析，进而筛选出具鉴别意义的有效参数，作为某种动物药常用鉴定指标。

2 分子生物技术

近年来分子生物学技术在中药质量评价中的应用才刚刚开始，但其特有的优点与好处迅速体现，分子生物鉴定方法鉴定能力较强，相比传统中药的鉴别方法，其准确性高、重现性好、真实、稳定。在鉴定没有背景信息的中药样品及在方法通用性和可数字化方面具有优势，应用前景广阔。

DNA基因鉴定是近年动物类中药鉴定中较为重要的分子生物技术，该技术从基因层面上鉴别药材，具有较高的准确性。DNA基因鉴定包括DNA分子遗传标记，核酸探针杂交，DNA条形码分子鉴定法等[4]。其中在动物类中药鉴定中发展较快较好的为DNA分子遗传标记和DNA条形码分子鉴定法。

2.1 DNA分子遗传标记 DNA分子遗传标记技术（DNA molecular makers） 是DNA水平遗传变异的直接反映。这种技术是一种以不同生物的个体遗传物质，即DNA的差异为根本来鉴别不同物种的方法。其原理在于生物的外观性状、组织结构、细胞形态、蛋白质及化学成分除了受遗传因素的影响外，还关系着生物的生长环境、生理状态和发育阶段等。但是DNA是遗传信息直接载体，不会受到以上因素的影响，所以DNA分子的遗传标记技术在对药材鉴定方面有更高的可靠性和准确性[39]。

用于DNA分子遗传标记的基因分为3种：一是叶绿体中的rbcL，matK，rpoC1，tmH-psdA等基因；二是核糖体中的18SrRNA，ITS1，ITS2等基因；三是线粒体中的Cytb，COI，12S rRNA，16S rRNA等基因。前两者适合鉴定植物，后两者则适用于动物鉴定[40]。

吴平[41]通过分析对乌龟、中华鳖和山瑞鳖线粒体12SrRNA基因片段序列来区分正品和混淆品。王义权等[42]扩增了乌梢蛇及其混淆品的Cytb基因片段，通过比较蛇的Cytb基因246 bp的同源DNA序列，可以准确区分乌梢蛇及其混淆品。王建云等[43]以梅花鹿血、鹿鞭、鹿茸、毛为鉴定对象，采用微量DNA提取技术扩增DNA片段，扩增产物纯化后用双脱氧链终止法测定其序列，发现梅花鹿毛、血、鹿鞭的DNA序列完全一致，证明其来源都是梅花鹿，而鹿茸由于其来源不详，与其他的梅花鹿DNA具有明显的差异。

2.2 DNA条形码分子鉴定法 DNA条形码（DNA barcoding） 是由加拿大动物学家Hebert等[44]首次提出，是利用标准的、有足够变异的、易扩增且相对较短的DNA片段自身在物种种内的特异性和种间的多样性而创建的一种新的身份识别系统，它可以对物种进行快速的自动鉴定。DNA条形码技术具有以下几个显著的特点：（1）直接利用DNA序列进行物种的鉴定，基于生物的基因型，具有独一无二的可重复性，DNA序列在生物个体发育过程中不会改变，同种生物不同生长期的DNA序列信息是相同的，即使经过加工，形态发生变化，而DNA序列信息不会改变，较之传统的方法，扩大了检测样本的范围，同时样本部分受损也不会影响识别结果；（2）DNA条形码序列具有通用性，只需一对或几对通用引物，在不同物种之间具有可比性，可以形成统一的标准，适用于非专家物种鉴定。设计一套实验流程，技术人员就可完成鉴定工作；（3）准确性高，鉴别速度快，特定的物种具有特定的DNA序列信息，而形态学鉴别特征会因趋同和变异导致物种的鉴别失误，通过建立DNA条形码数据库，可一次性快速鉴定大量样本[45]。DNA条形码由于其基因序列较短、有充足的基因变化、测序较为简单、鉴别度较高等优点正在逐年增加其在中药鉴定中的应用。特别是在名贵中药材方面发挥着重要的作用，不仅可以鉴别其真伪，亦能发现物种之间的生物亲缘关系，从而获得更加准确的物种分类信息。

王孟虎等[4]在《动物类中药DNA条形码鉴定研究进展》一文中指出DNA条形码分子鉴定法是传统鉴别方法的有效补充。由于不同物种的DNA序列是由腺嘌呤（A），鸟嘌呤（G），胞嘧啶（C），胸腺嘧啶（T） 4种碱基以不同顺序排列组成，因此对某一特定DNA片段序列进行分析即能够区分不同物种。崔丽娜等[46]对金钱白花蛇及其混伪品共4个种11份样品的COI条形码序列进行研究。最终由所构建的系统聚类树可以看出，同属聚在一起，且各物种又形成相对独立的支，银环蛇COI序列可明显与混伪品区分开，为金钱白花蛇的鉴别提供了新的方法，在其他动物药基源物种鉴定中也具有较大的应用价值。张红印等[47]以COI作为条形码序列，对蛤蚧实验样品进行DNA提取，PCR扩增和双向测序，最终得出结论运用COI条形码序列能够准确鉴定蛤蚧及其混伪品，为保障蛤蚧药材临床用药安全和市场监管提供新的方法。张蓉等[48]采用线粒体COI基因，在靠近5'端设计了一对鹿类DNA条形码通用引物，对来源于鹿科动物3个属共计19份样本的鹿茸进行PCR扩增和序列测定，发现除梅花鹿、马鹿的个别样本外DNA条形码鉴别方法对90%的鹿茸样本可进行有效地鉴定。

但由于该技术是通过基因进行鉴定，对实验材料及提取方法有较高要求，对一些年代较久的动物药材，其DNA降解较为严重，为DNA提取技术提出了较高的要求；该技术只能鉴别其来源是否准确却不能鉴别其药用部位是否准确，这就需要结合其他鉴别方法来准确鉴别其药用部位[4]。

3 免疫鉴别法

免疫鉴别法是一种特异性很强的鉴别方法，以药材中含有的特异蛋白为抗原，制备出特异的抗体，再与检验品中的特异抗原结合产生沉淀反应，据此鉴别药材的真伪。丁培贤等[49]利用虎、豹等骨骼中的特异抗原成分制备虎、豹骨等多种动物骨骼的抗体，还能将豹骨进一步鉴别为雪豹、云豹或金钱豹。

4 展望

传统鉴定方法是在长期的实践中总结和发展起来的，是前人智慧的结晶，在鉴定领域仍占据着重要的作用，是动物药鉴定的基石。随着技术的发展，传统鉴定方法逐渐向数字化技术发展。现代生物技术将成为动物研究鉴定的主潮流之一，我国的动物药鉴定研究，应当积极吸纳先进的科技手段，同时巩固发展传统鉴定方法，不断发展自己，走综合发展的道路，为动物类中药正本清源，净化动物药中药市场，促进中国传统医药的规范化、标准化和国际化的发展。