结肠癌中p—mTOR、p—p70S6K的表达与临床病理意义

赵溢斐+周逢强+徐宏

【摘要】 目的：探讨磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（p-mTOR）及其下游因子p-p70S6K在结肠癌中的表达情况，分析其与临床病理特征的关系。方法：应用免疫组织化学方法检测结肠癌组织、癌旁组织、正常结肠组织中p-mTOR、p-p70S6K的表达。结果：81例结肠癌组织中p-mTOR表达率为51.85%（42/81），显著高于正常结肠组织的21.74%（5/23）、癌旁组织35.80%（29/81），且p-mTOR的表达与TNM分期、结肠癌解剖位置相关（ 字2=7.617、5.358，P<0.05）。p-p70S6K在结肠癌的表达率为72.84%（59/81），且与p-mTOR的表达呈正相关（r=0.356，P=0.001）。结论：p-mTOR、p-p70S6K蛋白在结肠癌组织中高表达，且与结肠癌的发生、解剖部位、TNM分期有关，可作为结肠癌诊断和预后判断的指标。

【关键词】 p-mTOR； p-p70S6K； PI3K/AKT通路； 结肠癌

【Abstract】 Objective：To investigate the expression of mammalian target of rapamycin pamptomycin target protein（p-mTOR） and its downstream factor p-p70S6K in colonic carcinoma，and to analyze its relationship with clinicopathological features.Method：The p-mTOR and p-p70S6K expression was detected in normal，adjacent，and colonic carcinoma tissues using immunohistochemical method.Result：The expression rate of p-mTOR in 81 cases of colonic carcinoma was 51.85%（42/81），which was significantly higher than that in normal tissues（21.74%，5/23） or adjacent tissues（35.80%，29/81），and the expression of p-mTOR was correlated with TNM stage and colonic carcinoma location（ 字2=7.617，5.358，P<0.05）.The expression rate of p-p70S6K in colonic carcinoma was 72.84%（59/81） and was positively correlated with the expression of p-mTOR（r=0.356，P=0.001）.Conclusion：p-mTOR，p-p70S6K protein is highly expressed in colorectal cancer tissues and is related to the occurrence，anatomical site and TNM staging of colon cancer，which can be used as an index for the diagnosis and prognosis of colon cancer.

【Key words】 p-mTOR； p-p70S6K； PI3K/AKT pathway； Colorectal cancer

First-authors address：Binzhou Medical University，Yantai 264003，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2018.02.011

哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）是一种丝/苏氨酸蛋白激酶，多种信号通路汇聚于上，作为多种通路的中心环节，mTOR整合上游的信号和能量，控制基因的转录和蛋白质的合成，并且在肿瘤细胞的发生、血管生成、浸润、转移及化疗耐药中也发挥了重要作用[1-4]。核糖体S6蛋白激酶（P70S6K）为mTOR下游因子，在蛋白质翻译的延长阶段能加快翻译速度，进而促进细胞的侵袭和转移。p-mTOR、p-p70S6K分别是mTOR、p70S6K其磷酸化形式。研究表明，p-mTOR、p-p70S6K在多种实体肿瘤中异常表达[5-7]。因此，本实验以PI3K/AKT通路中的两个重要蛋白p-mTOR和p-p70S6K为观察指标，通过检测结肠癌组织、癌旁组织、正常结肠组织中上述蛋白的表达情况，探讨两者对结肠癌病理参数的影响并验证两者表达的相关性。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料来源 选取滨州市人民医院胃肠外科2016年2月-2017年2月结肠癌根治术病理标本共81例，所有病例术前均无化疗、放疗、靶向治疗及免疫治疗史。其中男45例，女36例；年龄33～81岁，平均62岁；其中右半结肠37例，左半结肠44例；肿瘤直径>3 cm 53例，肿瘤直径≤3 cm 28例；按照TNM临床分期标准分为Ⅰ期11例，Ⅱ期27例，Ⅲ期38例，Ⅳ期5例；伴有淋巴结转移57例，无淋巴结转移24例；有远处转移5例，无远处转移76例。同时取81例距肿瘤边缘5 cm以远的癌旁结肠组织、23例外伤患者的正常结肠组织作为对照。

1.2 主要试剂 p-mTOR兔抗人多克隆抗体购自Cell Signaling Technology公司，p-p70S6K兔抗人多克隆抗体购自Cell Signaling Technology公司，柠檬酸抗原修复液、磷酸盐缓冲液（PBS）及二氨基联苯胺（DAB）显色试剂均购自福州迈新生物技术公司。endprint

1.3 试验步骤 所有标本离体常规固定、脱水及石蜡包埋行厚4 μm连续切片，用Envision二步法免疫组化染色，p-mTOR、p-p70S6K一抗的工作浓度为1∶100，常規二甲苯脱蜡、梯度酒精水化、柠檬酸盐缓冲液高温高压抗原修复，一抗和二抗分别孵育、二氨基联苯胺显色、苏木素复染，中性树脂封片观察。用已知阳性的切片作为阳性对照，用磷酸盐缓冲溶液代替一抗作为阴性对照。

1.4 结果判定标准 p-mTOR蛋白主要定位于细胞质，部分位于细胞膜，阳性者细胞质可见黄色颗粒，p-p70S6K蛋白定位在细胞核，阳性染色为棕黄色或棕褐色颗粒样物质。每个标本至少计数100个细胞，基于染色强度和p-mTOR阳性肿瘤细胞百分比进行评分。染色强度：0分（无染色）、1分（弱染色）和2分（强染色），用染色强度乘以阳性细胞所占的比例，≤20为阴性，>20为阳性[8]。以上结果均至少由两位病理科医生以双盲法观察确定。

1.5 统计学处理 使用统计分析软件SPSS 21.0进行数据处理。计数资料以率表示，多组比较采用 字2检验，多组间两两比较的显著性水平经Bonferroni校正，相关性采用Spearman检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 p-mTOR蛋白在结肠癌中的表达及与病理参数的关系 p-mTOR在正常组织、癌旁组织、癌组织中的表达率分别为21.74%（5/23）、35.80%（29/81）、51.85%（42/81），比较差异有统计学意义（ 字2=8.370，P<0.05）。结肠癌中p-mTOR阳性率高于正常组织（ 字2=6.558，P<0.05），癌旁组织和正常组织无明显差异（P>0.05）。在临床病理参数中，p-mTOR蛋白表达率与TNM分期、结肠癌解剖位置相关（ 字2=7.617、5.358，P<0.05），但与分化程度、淋巴结转移无关（ 字2=2.026、2.138，P>0.05）。见表1、2及图1。

2.2 p-p70S6K蛋白在结肠癌中的表达及与病理参数的关系 p-p70S6K在正常组织及癌组织中的阳性率分别为38.10%（8/21）、56.79%（46/81）、72.84% （59/81），比较差异有统计学意义（ 字2=10.036，P<0.05）。结肠癌中p-p70S6K阳性率高于正常组织（ 字2=8.932，P<0.05），癌旁组织和正常组织无明显差异（P>0.05）。在临床病理参数中，p-p70S6K表达率与TNM分期、结肠癌解剖位置均相关（ 字2=7.675、6.164，P<0.05），但与分化程度、淋巴结转移均无关，差异均无统计学意义（ 字2=3.244、2.277，P>0.05）。见表1、2及图2。

2.3 p-mTOR与p-p70S6K表达的相关性 在81例结肠癌组织中，p-mTOR阳性表达42例中，p-p70S6K蛋白有阳性表达占37例，而p-mTOR表达阴性的39病例中，p-p70S6K蛋白阴性的占17例。经Spearman秩相关检验，显示p-mTOR及p-p70S6K蛋白在结肠癌组织中的表达呈正相关（r=0.356，P=0.001）。

3 讨论

信号通路的异常活化与肿瘤的发生、侵袭、转移密切相关。PI3K/AKT在细胞内发挥着抑制凋亡，促进增殖的作用。研究表明，PI3K/AKT通路在正常组织中处于失活状态，但在肿瘤组织中会异常激活[9]。PI3K/AKT通路的激活将赋予肿瘤细胞巨大的生长优势，使蛋白质合成量增加，同时抑制自噬，使得肿瘤细胞即使以高速增殖，也不易凋亡[10]。

mTOR是近年来发现的在进化上高度保守的蛋白激酶，其基因定位于1号染色体短臂，与细胞的凋亡、增殖、迁移、周期调控均密切相关。mTOR作为PI3K/AKT通路的下游蛋白，以其磷酸化形式p-mTOR在细胞内发挥活性[11]。然而，PI3K/AKT信号通路的激活，并未增加mTOR蛋白表达量，而是促进mTOR的磷酸化，在现有mTOR蛋白的基础上提高p-mTOR的占比[12]。所以，针对p-mTOR蛋白的研究更能反映出该通路在细胞内的激活程度。Cao等[13]发现p-mTOR在胃癌组织中的表达显著高于正常组织和癌旁组织。Murayama等[14]发现，胃癌中p-mTOR的表达与肿瘤的浸润深度、淋巴结受累、TNM分期均呈正相关。Gille等[15]证实，p-mTOR能作用于血管内皮细胞，选择性激活VEGF（血管内皮生长因子），诱导血管生成，保障实体肿瘤的血供，为血行播散提供结构基础。Melling等[16]发现p-mTOR在左半结肠癌的表达率显著高于右半结肠癌，并推测其与微卫星不稳定性（MSI）及遗传性非息肉病结肠癌综合征（HNPCC）在左半结肠癌中的发生率较低有关。Ueng等[17]研究表明p-mTOR与乳腺癌的生存期相关。这提示p-mTOR的表达可能对结肠癌的发生、侵袭、转移、分化程度及远期预后均有一定影响。

在体内p-mTOR通过磷酸化多种蛋白来发挥其生理作用，p70S6K则是其最重要的底物之一。p70S6K存在于mRNA的5帽端，p-mTOR磷酸化其T389位点使其激活。研究表明，p-p70S6K能激活细胞周期依赖性蛋白激4（CDK4）[18]、细胞周期素（Cyclin）[19]，加快细胞分裂G期进展，缩短细胞周期，促进肿瘤的发生。Wang等[20]发现，p-p70S6K作用于真核生物延长因子2（eEF2）、细胞程序性死亡蛋白（PDCD4）提高mRNA的翻译速度，促进肿瘤的增殖。Park等[21]证实，p-p70S6K可促进肌动蛋白细丝重构，促进细胞运动，导致肿瘤的侵袭和转移。

在本实验中，笔者发现p-mTOR、p-p70S6K蛋白在结肠癌中的表达率显著高于正常结肠组织、癌旁组织（P<0.05），说明结肠癌发生与p-mTOR、p-p70S6K蛋白关系密切。本实验还发现，p-mTOR、p-p70S6K蛋白的表达与TNM分期密切相关，但与肿瘤的直径、分化程度、淋巴结转移无关，这与Murayama等[14]的结果有一定的差异，可能是标本组织的来源不同导致的肿瘤生物学行为的差异。根据实验结果，笔者发现p-mTOR在左半结肠癌的表达率显著高于右半结肠癌，但具体机制目前不甚明了，Melling等[16]曾推测其与微卫星不稳定有关，但目前尚缺乏实验数据支持，有待进一步研究。endprint

本研究结果为进一步研究参与结肠癌细胞发生、侵袭、转移等的具体机制提供了一定的研究思路，同时联合检测结肠癌中p-mTOR及p-p70S6K蛋白的表达有利于了解结肠癌的生物學行为，为结肠癌的早期诊断、靶向治疗、预后判断提供了一个有效的靶点。

参考文献

[1] Zhong J T，Yu J，Wang H J，et al.Effects of endoplasmic reticulum stress on the autophagy，apoptosis，and chemotherapy resistance of human breast cancer cells by regulating the

PI3K/AKT/mTOR signaling pathway[J].Tumour Biol，2017，39（5）：1393392102.

[2] Mao D，Lei S，Ma J，et al.[Effect of jianpi-jiedu formula on tumor angiogenesis-relevant genes expression in colorectal cancer][J].Zhong Nan Da Xue Xue Bao Yi Xue Ban，2016，41（12）：1297-1304.

[3] Jiang Z，Liu Y，Wang C.Oncogenic Nanog P8 expression regulates cell proliferation and migration through the Akt/mTOR signaling pathway in human gastric cancer-SGC-7901cell line[J].Onco Targets Ther，2016，9：4859-4866.

[4] Lakiotaki E，Levidou G，Angelopoulou M K，et al.Potential role of AKT/mTOR signalling proteins in hairy cell leukaemia：association with BRAF/ERK activation and clinical outcome[J].Sci Rep，2016，6：21252.

[5] Krencz I，Sebestyen A，Fabian K，et al.Expression of mTORC1/2-related proteins in primary and brain metastatic lung adenocarcinoma[J].Hum Pathol，2017，62：66-73.

[6] Pistelli M，Ballatore Z，Santinelli A，et al.Phosphorylated mTOR is associated to androgen receptor expression in early triple-negative breast cancer[J].Oncol Rep，2016，36（2）：755-762.

[7] Yaba A，Bozkurt E R，Demir N.mTOR expression in human testicular seminoma[J].Andrologia，2016，48（6）：702-707.

[8] Herberger B，Puhalla H，Lehnert M，et al.Activated mammalian target of rapamycin is an adverse prognostic factor in patients with biliary tract adenocarcinoma[J].Clin Cancer Res，2007，13（16）：4795-4799.

[9] Murakami D，Tsujitani S，Osaki T，et al.Expression of phosphorylated Akt（pAkt） in gastric carcinoma predicts prognosis and efficacy of chemotherapy[J].Gastric Cancer，2007，10（1）：45-51.

[10] Hare S H，Harvey A J.mTOR function and therapeutic targeting in breast cancer[J].Am J Cancer Res，2017，7（3）：383-404.

[11] Kozma S C，Thomas G.Regulation of cell size in growth， development and human disease：PI3K，PKB and S6K[J].Bioessays，2002，24（1）：65-71.

[12] Yang H Y，Xue L Y，Xing L X，et al.Putative role of the mTOR/4E-BP1 signaling pathway in the carcinogenesis and progression of gastric cardiac adenocarcinoma[J].Mol Med Rep，2013，7（2）：537-542.

[13] Cao G D，Xu X Y，Zhang J W，et al.Phosphorylated Mammalian Target of Rapamycin p-mTOR Is a Favorable Prognostic Factor than mTOR in Gastric Cancer[J].PLoS One，2016，11（12）：e168085.endprint

[14] Murayama T，Inokuchi M，Takagi Y，et al.Relation between outcomes and localisation of p-mTOR expression in gastric cancer[J].Br J Cancer，2009，100（5）：782-788.

[15] Gille H，Kowalski J，Li B，et al.Analysis of biological effects and signaling properties of Flt-1（VEGFR-1） and KDR（VEGFR-2）.A reassessment using novel receptor-specific vascular endothelial growth factor mutants[J].J Biol Chem，2001，276（5）：3222-3230.

[16] Melling N，Simon R，Izbicki J R，et al.Expression of phospho-mTOR kinase is abundant in colorectal cancer and associated with left-sided tumor localization[J].Int J Clin Exp Pathol，2015，

8（6）：7009-7015.

[17] Ueng S H，Chen S C，Chang Y S，et al.Phosphorylated mTOR expression correlates with poor outcome in early-stage triple negative breast carcinomas[J].Int J Clin Exp Pathol，2012，

5（8）：806-813.

[18] Yamazaki T，Akada T，Niizeki O，et al.Puromycin-insensitive leucyl-specific aminopeptidase（PILSAP） binds and catalyzes PDK1，allowing VEGF-stimulated activation of S6K for endothelial cell proliferation and angiogenesis[J].Blood，2004，104（8）：2345-2352.

[19] Xu Y，Luo Q，Lin T，et al.U12，a UDCA derivative，acts as an anti-hepatoma drug lead and inhibits the mTOR/S6K1 and cyclin/CDK complex pathways[J].PLoS One，2014，9（12）：e 113479.

[20] Wang X，Li W，Williams M，et al.Regulation of elongation factor 2 kinase by p90（RSK1） and p70 S6 kinase[J].EMBO J，2001，20（16）：4370-4379.

[21] Park C M，Park M J，Kwak H J，et al.Ionizing radiation enhances matrix metalloproteinase-2 secretion and invasion of glioma cells through Src/epidermal growth factor receptor-mediated p38/Akt and phosphatidylinositol 3-kinase/Akt signaling pathways[J].Cancer Res，2006，66（17）：8511-8519.

（收稿日期：2017-09-25） （本文編辑：程旭然）endprint