HIF—1α与TLR4在鼻息肉组织中的表达及相互关系

崔粲+任金龙+王银霞

【摘要】 目的：检测HIF-1α、TLR4在鼻息肉组织中的表达及相关性，探讨其在鼻息肉发病机制中可能的作用。方法：选取30例经鼻内镜手术治疗的鼻息肉患者的鼻息肉组织为试验组，及同期30例经鼻中隔偏曲矫正术治疗的患者的下鼻甲黏膜为对照组。采用免疫组织化学染色技术检测两组标本中HIF-1α、TLR4的表达情况。结果：试验组HIF-1α、TLR4表达水平均明显高于对照组，差异均有统计学意义（P<0.01）；经Pearson相关性分析得出，试验组中HIF-1α、TLR4表达呈显著正相关性（r=0.907，P<0.01）。结论：HIF-1α、TLR4在鼻息肉组织中表达水平上调并且呈显著正相关性，提示鼻息肉发生过程中组织缺氧、感染存在，HIF-1α、TLR4可能通过某种机制相互促进，共同导致鼻息肉的发生。

【关键词】 鼻息肉； HIF-1α； TLR4

【Abstract】 Objective：To investigate the expression and correlation of HIF-1α and TLR4 in nasal polyps，and to discuss the possible role of them in the pathogenesis of nasal polyps. Method：The nasal polyps of 30 patients with nasal polyps treated by nasal endoscopic surgery were selected as the experimental group，the same period，the inferior turbinate mucosa of 30 patients with nasal septum surgery were selected as the control group.Immunohistochemical staining technique was used to detect the expression of HIF-1α and TLR4 in two groups of specimens.Result：The expression levels of HIF-1αand TLR4 in the experimental group were significantly higher than those in the control group，and the differences were statistically significant（P<0.01）.Pearson correlation analysis showed that there was a significant positive correlation between the expression of HIF-1αand TLR4 in the experimental group（r=0.907，P<0.01）.Conclusion：The levels of HIF-1α and TLR4 in nasal polyps are up-regulated and positively correlated，it suggests that tissue hypoxia and infection exist during nasal polyps，HIF-1αand TLR4 may promote each other through some mechanism，which can lead to nasal polyps.

【Key words】 Nasal polyp； HIF-1α； TLR4

First-authors address：Graduate School of Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2018.02.001

鼻息肉是鼻腔及鼻窦黏膜的慢性炎症性疾病，致病因素目前不清楚，考虑是许多诱因综合作用的结果，其组织学特征为组织间隙水肿，嗜酸性粒细胞为主的炎性细胞浸润，基质中有散在、不成熟的血管交错，缺乏正常神经支配及细胞连接[1]。近年来研究表明鼻腔、鼻窦黏膜组织的缺氧及感染可能促进了鼻息肉的形成及发展，而HIF-1α、TLR4在组织中异常表达或许起主导作用[2-4]。HIF-1由HIF-1α和HIF-1β两亚基聚合而成，负责调控低氧环境中组织细胞增殖、代谢及内环境稳定，而HIF-1α为HIF-1表达水平、活性及稳定性调控亚基[5]。TLR4受体为天然免疫模式识别受体，是Toll样受体的主要组成部分，主要通过识别病原微生物的细胞壁成分激活机体免疫系统，发挥免疫防御及免疫调节等作用[6]。本试验旨在运用免疫组织化学染色技术检测上述两因子在鼻息肉中的表达情况，进一步明确HIF-1α、TLR4在鼻息肉发生中的作用及可能的内在关系。现报道如下。

1 資料与方法

1.1 一般资料 鼻息肉组织来源于2016年

3月-2017年3月在山西医科大学附属汾阳医院耳鼻咽喉科行鼻内镜手术治疗的30例鼻息肉住院患者列为试验组，选取同期30例行鼻中隔偏曲矫正下鼻甲部分切除术治疗的鼻中隔偏曲住院患者的下鼻甲黏膜组织为对照组。试验组纳入标准：根据患者症状、体征及辅助检查诊断为鼻息肉并且术后经病理证实。对照组纳入标准：根据患者症状、体征、辅助检查诊断明确且需手术治疗的患者。排除标准：所有患者均可排除变应性鼻炎、支气管哮喘、阿司匹林三联征、囊性纤维化等疾病，并且术前2周内均未使用过糖皮质激素、抗组胺类药物，未患过流行性感冒等病毒性疾病及上呼吸道感染。标本取材经医院伦理委员会批准，并告知患者经得患者同意且术前签知情同意书。试验标本均取材于术中，endprint

-78 ℃冰箱保存，10%中性福尔马林溶液固定，然后进行石蜡包埋，制成石蜡块储存。

1.2 免疫组织化学染色检测 采用免疫组织化学染色SABC法。石蜡块经切片机连续3 μm切片制成石蜡切片，经烤片机60 ℃烘烤0.5 h使切片紧密黏附。切片脱蜡至水，抗原热修复。加入5%BSA封闭液37 ℃孵育30 min甩干。分别滴加一抗小鼠抗人HIF-1α、TLR4单克隆抗体（sc-13515，sc-293072购于美国Santa Cruz公司），工作浓度为1∶50，4 ℃过夜。滴加二抗生物素标记山羊抗小鼠IgG（购于武汉博士德SA1021-小鼠IgG即用型免疫组化染色试剂盒），37 ℃孵育30 min。PBS冲洗5 min×3次。滴加SABC，37 ℃孵育30 min，PBS冲洗5 min×3次。滴加DAB，镜下控制反应时间，然后自来水冲洗终止反应。苏木素复染2 min，放入盐酸酒精分化液中分化数秒。脱水、透明、封片。PBS代替上述一抗做阴性对照。

1.3 免疫组织化学染色结果判定 HIF-1α以细胞质或细胞核出现棕黄染色为阳性细胞，TLR4以细胞膜或细胞质出现棕黄染色为阳性细胞。使用美国aperio公司Scanscope数字病理扫描系统，每张组织切片于400倍镜下随机选取5个不重叠的阳性区域，统一测量窗下，读取锁定区域的灰度值，取均值。

1.4 统计学处理 采用SPSS 19.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（x±s）表示，比较采用独立样本t检验；计数资料以率（%）表示，比较采用 字2检验。应用Pearson相关性分析研究指标间的相关性。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患者基线资料比较 试验组30例患者，其中男17例，女13例，年龄22～70岁，平均（43.3±5.2）岁；对照组30例患者，其中男19例，女11例，年龄27～68岁，平均（42.5±4.3）岁。两组患者一般资料比较，差异均无统计学意义（P>0.05），具有可比性。

2.2 免疫组织化学染色检测结果 HIF-1α在鼻息肉组织主要表达于上皮细胞、腺体细胞、部分炎性细胞及血管内皮细胞细胞质或细胞核内，染色呈棕黄色；在下鼻甲黏膜组织仅表达于部分上皮细胞细胞质或细胞核内，染色黄色至棕黄色不等。TLR4在鼻息肉组织主要表达于上皮细胞、腺体细胞、固有层炎性细胞细胞膜或细胞质中，染色呈棕黄色；在下鼻甲黏膜组织表达于上皮细胞、腺体细胞及部分炎性细胞细胞膜或细胞质中，染色黄色至棕黄色不等。见图1～4。

2.3 两组HIF-1α、TLR4灰度值比较 试验组HIF-1α、TLR4灰度值均低于对照组，差异均有统计学意义（P<0.01），见表1。采用Pearson相关性分析，试验组中HIF-1α、TLR4表达呈显著正相关性（r=0.907，P<0.01），见图5。

3 讨论

HIF-1由Semenza等[7]于1992年在缺氧环境培养下细胞的核提取物中首次发现，随后不久其分子结构鉴定为异源二聚体，由分子量120 kD的HIF-1α和91/93/94 kD的HIF-1β两个亚单位组成。HIF-1α与HIF-1β均为基本的螺旋-环-螺旋（basic-helix-loop-helix，bHLH）转录因子超家族成员，具有Per-AHR/ARNT-Sim（PAS）结构域。HIF-1α是保证缺氧诱导蛋白HIF-1稳定性、决定表达水平、维持生物活性所必需的亞基，具有低氧依赖性，而HIF-1β仅仅起到结构性作用并且表达水平稳定[8]。当细胞内环境出现缺氧信号时，HIF-1α分解受抑制，HIF-1生物活性增强。HIF-1α与HIF-1β聚合成大量HIF-1分子，进入细胞核内与转录因子协调作用，调节缺氧相关基因及靶向基因的表达，使细胞适应缺氧，并维持代谢、增殖、诱发炎症反应等。近年来发现鼻息肉患者常常合并窦口-鼻道复合体解剖学结构异常，如中鼻道狭窄、鼻甲肥大、窦口堵塞，并且息肉往往起源于中鼻道及鼻窦腔。Tos等[9]认为中鼻道的血流量较其他部位低，息肉组织中血流量更低，缺氧环境可能是鼻息肉发生的孵育器。与缺氧环境关系最为密切的细胞因子是HIF-1α，Chien等[10]通过RT-PCR和免疫组织化学染色来检测鼻息肉组织和正常下鼻甲黏膜中的HIF-1α表达情况，推测出HIF-1α高水平表达可加重炎症反应及组织水肿、细胞缺氧损伤并导致鼻息肉形成。经研究发现，当组织处于缺氧环境下，HIF-1α也可通过PI3K/Akt通路的激活来提高表达水平同时促进一氧化氮合酶的生成，使下游靶基因产物VEGF表达增多，从而诱发组织水肿及趋化炎性细胞浸润[11-15]。杨琳红[16]通过建立无血清原代人鼻黏膜上皮细胞培养体系及低氧体系，运用原位杂交及Western Blot对HIF-1α及其靶向产物进行检测，肯定了HIF-1α对鼻息肉发生、发展中的意义。在本项研究中发现，HIF-1α蛋白表达水平在试验组较健康对照组升高，且差异有统计学意义（P<0.01），提示HIF-1α在鼻息肉发生发展中有着重要的促进作用。再次证实了鼻息肉组织中缺氧环境的存在，HIF-1α的过表达促进了鼻息肉的产生。

TLR4是固有免疫防御体系中重要的模式识别受体，其配体主要为人体致病微生物细胞壁成分，表达在免疫组织及细胞表面[17]。属于经典Ⅰ型跨膜蛋白，由胞外区、跨膜区和胞质区组成。胞外区由富亮氨酸的氨基酸重复序列构成，结构域呈马蹄状，与配体结合的重要结构。跨膜区及胞质区主要发挥信号转导作用。当受体与配体结合后，可激活MyD88信号通路，分泌各种细胞因子、启动免疫细胞应答、诱发炎症反应以消灭入侵致病微生物。同时在TLR4信号通路下游有NF-κB因子，主要介导免疫因子及炎性因子的表达调节，有研究发现其与炎症瀑布效应及免疫失控自身损伤关系密切[18]。大量资料显示鼻息肉患者鼻腔分泌物及术中黏膜取样G-细菌、真菌等病原体检出率较高。王成硕等[4]首次使用原位杂交技术发现TLR4mRNA在鼻息肉组织中表达较高与对照组比较差异有统计学意义，论证鼻息肉发病过程感染因素的存在。病原体感染可导致鼻息肉发病已是不争的事实。国外用特殊感染病原体诱发呼吸道上皮细胞TLR4高表达，呼吸道炎症反应明显、细胞损伤较重，抑制TLR4表达后减轻了上皮细胞损伤，认为TLR4异常表达对机体不利[19]。顾兆伟等[20]采用免疫组织化学染色技术检测鼻息肉组织中TLR4蛋白表达，TLR4 表达水平与炎症、病变程度大致呈正相关，提示TLR4高表达可能与鼻息肉形成有关。Cho等[21]证实细菌细胞壁脂多糖可通过TLR4触发免疫应答激活MAPK和PI3K/Akt信号通路参与鼻息肉组织的重塑，进一步论证TLR4的异常表达可参与鼻息肉的形成。本研究中TLR4在试验组表达水平明显高于对照组（P<0.01），镜下可见鼻息肉组织中大量炎症细胞浸润、组织水肿严重与先前研究结果基本保持一致，可以推测出虽然TLR4作为机体固有免疫防线，但是在表达高度上调发挥免疫防御角色时，也诱发了鼻黏膜持续炎症反应及损伤，最终可诱发鼻息肉形成。endprint

HIF-1α与TLR4在鼻黏膜息肉病变发生机制上的研究仍尚不明朗。笔者采用Pearson相关性分析发现鼻息肉组织中HIF-1α、TLR4表达呈高度正相关性（r=0.907，P<0.01）。之前有研究证实当抑制鼻息肉组织TLR4表达后，HIF-1α的靶向产物表达受抑制[22]。结合本次研究结果可以推测出HIF-1α与TLR4之间可能存在交叉对话，它们共同促进了鼻息肉的形成与发展，但具体机制尚待进一步研究证明。

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（收稿日期：2017-09-25） （本文编辑：程旭然）endprint