间充质干细胞来源外泌体与肺动脉高压

黄菲菲，王良兴，黄晓颖

（温州医科大学附属第一医院 呼吸内科，温州市呼吸循环重点实验室，浙江 温州 325015）

外泌体（exosomes，EXOs）是由HARDING等[1]在1983年首次发现。最初认为EXOs是由成熟红细胞分泌，用于排出转铁蛋白的结构，但随着研究的深入，发现人体内大部分细胞皆可分泌EXOs，且其功能主要取决于来源细胞[2]。肺动脉高压（pulmonary arterial hypertension，PAH）发病机制尚未明确，尚无特效药。有研究表明，间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）能够产生EXOs，并有报道其可抑制平滑肌细胞增殖、降低PAH[3]。笔者就MSCs来源EXOs与PAH的研究进展做一综述。

1 EXOs

1.1 EXOs概述 EXOs是一种纳米级结构，它由脂质双分子层包裹，直径介于30～100 nm之间，能够通过各种各样的方式广泛分布于唾液、血浆、尿液等体液中[4]。EXOs内含有多种蛋白质，其中四跨膜蛋白家族含量最丰富，包括CD63、CD81、CD82、CD9等，存在于大多数不同来源的EXOs中。EXOs内还含有actins、annexins、TSG101（tumor susceptibility gene 101 protein）、fibronectin-1、VAMP8（vesicle-associated membrane protein 8）等与细胞的运动、组装、形态等有关的蛋白质[5]。此外，EXOs中还有miRNA、mRNA、tRNA、rRNA等不同种类的RNA。miRNA是一类包含20～25个核苷酸的非编码RNA家族，它们不编码蛋白质，但能够通过与特定的mRNA结合并使之降解来调节mRNA的翻译水平，从而调控目标基因转录后水平上的表达。miRNA可以通过EXOs在细胞之间水平传递[6]，使细胞内不同miRNA的含量根据环境的变化而发生改变。EXOs中也含有丰富的脂质成分，主要包括胆固醇、鞘磷脂、神经酰胺以及卵磷脂等[7]，这些脂质不仅组成了EXOs的膜，在内容物的分选上也发挥了重要作用。

图1 EXOs形成和分泌

1.2 EXOs形成机制和功能 EXOs首先由细胞膜内出芽形成早期内体，早期内体膜内出芽，包裹内容物形成腔内体，随即成熟为多囊泡体（晚期内体），多囊泡体最后与细胞膜融合，释放腔内体至细胞外形成EXOs（见图1）。蛋白质、miRNA、脂质等不同的内容物被分选进入多囊泡体，需要依赖于不同的机制，包括ESCRT（endosomal sorting complexes required for transport）依赖性和ESCRT非依赖性机制。成熟的多囊泡体膜与细胞膜融合并释放EXOs，被释放到细胞外的EXOs会以旁分泌或自分泌的方式，在人体内各种生理和病理过程中发挥作用，它们可以通过受体配体相结合、与受体细胞胞膜直接结合或与受体细胞胞膜相互融合的方式，实现细胞间的信号传递与物质交换。自从发现EXOs以来，人们越来越关注EXOs对疾病的治疗作用。大量研究表明，来源于不同细胞、不同环境的EXOs在功能上具有显著的差别。曹蕾等[8]将小鼠黑素细胞瘤来源的EXOs与MSCs共同培养发现，MSCs获得了黑素细胞瘤的增殖和迁移能力，这表明黑素细胞来源的EXOs具有黑素细胞瘤的特性。然而，ONO等[9]将乳腺癌细胞系与人骨髓MSCs来源的EXOs共培养，发现EXOs可以有效抑制肿瘤细胞增殖，促进其休眠。此外，有研究利用人脐带MSCs来源EXOs在体外治疗人肝癌细胞，发现EXOs能抑制丙肝病毒复制，并且其与抗病毒药物具有协同治疗作用[10]。因此，选择合适来源的EXOs是利用EXOs治疗相关疾病的重要一环。EXOs在宏观组成上都含蛋白质、脂质、RNA等物质，但是在微观构成中存在明显的差异，不同细胞分泌的EXOs，由于其所处的微环境不同，导致内含的蛋白质、脂质和RNA等在种类及比例上都各不相同，这可能是造成EXOs功能各异的主要原因。

2 MSCs

2.1 MSCs概述 MSCs是一种多潜能的非造血前体细胞，来源于很多成熟组织，尤其是骨髓、脂肪组织和脐带，不同组织来源的MSCs有许多相似之处[11]。MSCs不仅可以分化为软骨、肝组织、肌肉、韧带、肌腱等，还能向受损组织趋化[12]，通过旁分泌方式释放细胞因子，发挥对组织器官的修复和保护作用，是一种有前景的能够用于疾病治疗的干细胞来源。

2.2 MSCs旁分泌作用 1996年HAYNESWORTH等[13]发现MSCs能够合成和分泌不同种类的生长因子、细胞因子和趋化因子，调节附近细胞的功能，这是MSCs的旁分泌作用的首次报道。MSCs通过旁分泌作用释放上述物质，促进血管再生、抗炎、抗氧化应激和调节免疫反应。BABER等[14]给大鼠气管内注射转染了报告基因lacZ的MSCs，发现MSCs可降低肺血管阻力，减轻心室肥厚，有效缓解野百合碱诱导的PAH。他们还通过进一步实验证明lacZ标记的MSCs只存在于肺实质细胞中，并不存在于肺血管中，说明MSCs不是直接作用于肺血管，而可能是通过间接途径影响肺血管。LIANG等[15]发现用培养MSCs的培养基处理肺动脉平滑肌细胞可抑制肺动脉平滑肌细胞的增殖。此外，GNECCHI等[16]也发现给予MSCs培养基可使梗死心肌获得改善心功能和抑制心室重塑的效应，并发现MSCs条件培养基中血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、表皮生长因子-2（epidermal growth factor-2，EGF-2）、肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor，HGF）、胰岛素样生长因子-1（insulin like growth factor-1，IGF-1）和胸腺素β-4（thymosin，TB4）等心功能调节因子的表达均上调，由此可见，MSCs对心功能的恢复作用可能是通过分泌相应的调节因子起作用的。最近研究表明，MSCs通过旁分泌VEGF、血小板衍生生长因子（platelet derived growth factor，PDGF）等细胞因子促进受损兔角膜的愈合[17]。尽管MSCs能够根据特定的环境分化成内皮细胞、脂肪细胞、成纤维细胞、软骨细胞、肺上皮细胞、心肌细胞和胰腺细胞等，但是向病变部位趋化的MSCs由于受到移植环境中不良因素的影响生存率较低，只有很少部分的移植MSCs会出现在靶组织中[12]，不足以分化出充足的细胞来代替修复受损组织，在MSCs保护和修复组织器官中旁分泌起到了更大的作用，而在MSCs以旁分泌方式发挥作用的过程中，EXOs可能起到了关键作用[18]。

3 MSCs来源EXOs在PAH中的作用

3.1 PAH概述 PAH是一种进展性疾病，主要表现为肺动脉压升高、右心室功能失调，最终因为右心衰竭导致死亡。PAH的血流动力学诊断标准为静息状态下，右心导管法检测平均肺动脉压力（mean pulmonary arterial pressure，mPAP）≥25 mmHg。虽然目前PAH的治疗药物有前列环素、内皮素受体拮抗剂、磷酸二酯酶5抑制剂等，PAH患者1年病死率仍高达15%[19]，而且这些药物无法逆转PAH病程，因此探明PAH的发病机制，寻找能够真正逆转PAH的方法成为十分重要的研究课题。

3.2 MSCs来源EXOs与PAH 研究发现，MSCs可以显著降低PAH动物右心室压，抑制右心肥厚、肺血管重塑，减缓PAH的发展[20]。此外，研究证明MSCs条件培养基能抑制血管平滑肌增生，抑制PAH[21-22]。因此，MSCs发挥对PAH的治疗和保护作用，EXOs可能是重要环节。LEE等[3]发现MSCs来源的EXOs获得了MSCs的功能。低氧诱导的肺动脉高压（hypoxic pulmonary arterial hypertension，HPH）小鼠静脉注射MSCs来源的EXOs，抑制了低氧引起的STAT3和miR17超家族水平的升高，同时增加了miR204的含量，从而抑制肺动脉平滑肌细胞的增殖和降低肺动脉压。STAT3能够直接调节肺动脉内皮细胞中的微小RNA miR-17-92基因簇的转录，致使骨形态发生蛋白受体2型（bone morphogenetic proteins receptor 2，BMPR2）降低[23]。BMPR2是转化生长因子β（transforming growth factor-β，TGFβ）家族受体，与配体结合后能够抑制肺动脉平滑肌细胞增殖并促进其凋亡，它的减少会导致PAH的发生[24]。CHEN等[25]研究表明，MSCs来源的直径在40～300 nm的胞外囊泡有助于降低大鼠mPAP和右心室平均压力，减轻右心室肥厚，抑制肺细小动脉重塑。ALIOTTA等[26]证明MSCs来源的胞外囊泡能够减轻并逆转野百合碱诱导的小鼠PAH，由于胞外囊泡中含有EXOs和微囊泡等不同的成分，所以他们将MSCs来源的胞外囊泡、EXOs和微囊泡分别注射入PAH小鼠体内，发现只有MSCs来源的胞外囊泡和EXOs能够产生上述作用，进一步证实MSCs来源的胞外囊泡中，真正起到抑制PAH作用的成分是EXOs。上述研究充分说明，MSCs来源EXOs对PAH有积极的治疗作用（见图2）。动物实验表明，部分miRNA在PAH组织中表达异常[27]。MSCs来源EXOs有可能是通过与肺组织之间发生miRNA的水平传递，影响肺组织中的miRNA种类及含量，发挥保护PAH的作用，但具体机制还有待更进一步的研究。

图2 EXOs对PAH的作用

4 EXOs的应用前景

PAH与肿瘤在分子机制方面有许多相似的改变[28]，如具有相似的BMPR2基因的改变；此外，原癌蛋白survivin和pim1、低氧诱导因子（hypoxia-inducible factor，HIF-1）的表达也都被上调，这有可能是引起PAH动脉平滑肌细胞和肿瘤细胞增殖的共同原因。有临床研究表明，用自体EXOs治疗III/IV期黑色素瘤患者，能有效延缓肿瘤生长速度，并且其不良反应很小[29]。基于此，合适来源的EXOs对人类PAH可能也具有抑制平滑肌细胞增殖，缓解PAH的作用。

EXOs不仅携带有其来源细胞的某些功能和特性，同时还能被改造、加工和修饰。有研究表明，将化疗药物紫杉醇、阿霉素加入到人脑内皮细胞来源的EXOs培养基中，待EXOs摄取化疗药物后通过微注射方式将其注射入斑马鱼主静脉中，发现化疗药物能有效通过血脑屏障发挥其治疗作用[30]。因此，基于MSCs来源的EXOs对PAH的治疗作用，以及EXOs能被加工的特性，可以考虑对EXOs进行改造、加工和修饰。目前EXOs临床应用尚少，且主要集中于肿瘤领域，但动物实验表明[3]，MSCs来源EXOs确实能够抑制PAH，具有进一步研究的前景。

相对于传统的MSCs的移植治疗方法，利用MSCs来源的EXOs有效避免了MSCs移植存活率低的问题，且可以降低手术损伤、防止MSCs分化成其他细胞、降低MSCs促进肿瘤生长[31]以及动静脉注射细胞引起血管阻塞的可能性[32]。将EXOs通过静脉注射到动物体内，不会对肝肾功能、血流动力学、血管、肌肉等造成损害，也不会引起过敏反应，这使得利用EXOs来治疗PAH具有许多MSCs移植所不具备的优点。

5 小结与展望

目前对EXOs的研究主要集中在肿瘤领域，在PAH方面的研究仍处于初始阶段，我们还需要大量的科学研究来探索MSCs-EXOs对PAH的作用机制及治疗效果，从而为进一步的临床研究打下基础。