土忍翘薇合剂对大鼠CYP450酶活力和mRNA的调控作用

黄爱芳，王陈翔，周晓洁，金辉，周彬，余旭奔，林观样

（温州医科大学附属第一医院 药学部，浙江 温州 325015）

细胞色素P450（cytochrome P450，CYP450）是体内多种内源性和外源性物质的主要代谢酶，其活力改变能使相关物质代谢环节受到干扰，引起生物学效应的变化[1]。CYP450酶的诱导或抑制作用是导致药物间相互作用的主要原因之一，当两种或两种以上药物合用或前后序贯用药时，其中一种能通过调节CYP450酶的活力影响另一种药物的体内代谢过程。除化学药物外，也有文献[2]报道中药能通过对CYP450酶的调节间接影响在用药物的血药浓度和半衰期，导致被影响药物疗效和不良反应的变化。

土忍翘薇成方于已故老中医陈苏生，由土茯苓、忍冬藤、连翘和白薇组成，在陈苏生医案[3]和《陈苏生医集纂要》[4]中均有记载。该组方具有搜风通络、解毒利湿的作用，可用于拮抗激素不良反应。中药的化学成分是其药理作用的物质基础，土茯苓、忍冬藤、连翘和白薇这四味中药均含有黄酮类和天然甾体成分[5-8]，它们可以改变代谢酶的活性中心构象或者竞争代谢酶的结合位点，使其酶活力发生改变。因此本研究设计以非那西丁、安非他酮、氯唑沙宗、咪达唑仑为探针底物，考察土忍翘薇方对体内CYP1A2、CYP2B1、CYP2E1、CYP3A1代谢活力的影响，同时检测4种亚型酶的基因表达水平，综合分析土忍翘薇方使用后代谢酶的变化，以预测合用药物时的代谢规律。

1 材料

1.1 实验动物 雄性8周SD大鼠20只，体质量220～250 g，购自温州医科大学动物实验中心，动物生产许可证号：SCXK（浙）2015-0001，动物使用许可证号：SYXK（浙）2015-0009，饲养于温州医科大学动物实验中心，室温控制在（25±3）℃，常规饲料喂养，自由饮水。

1.2 主要仪器 XEVO TQ-S micro质谱仪，配备电喷雾离子源（美国Waters科技有限公司）；ACQUITY超高效液相色谱仪（美国Waters科技有限公司）；DU640核酸和蛋白分析仪（美国Beckman仪器有限公司）；MyCycler热循环仪（美国Bio-Rad有限公司）；7500 RT-PCR仪（美国Applied Biosystems科技有限公司）。

1.3 试剂 咪达唑仑（批号：171250-200401）、安非他酮（批号：100671-201001）和地西泮（批号：171225-200903）购自中国食品药品检定研究院；非那西丁（批号：STBB2177M9）、氯唑沙宗（批号：B（乙腈），梯度洗脱：0～1.5 min（10%～70% B），1.5～2.2 min（70%～70% B），2.2～2.5 min（70%～10% B），2.5～4.0 min（10%～10% B）。ESI（电喷雾离子源），源温度150 ℃，脱溶剂气温度500 ℃，锥孔气流量50（L/Hr），脱溶剂气流量1 000（L/Hr），氩气流量0.15 mL/min。采用多反应离子监测模式（MRM）进行定量，各探针药和内标的检测参数如表1所示。

表1 探针药及内标的检测参数

2.1.4 探针药浓度计算：非那西丁和氯唑沙宗在5～5 000 ng/mL血药浓度范围，安非他酮和咪达唑仑在5～1 000 ng/mL血药浓度范围制备标准曲线并进行方法学考察。血样经2.1.2项下处理后根据2.1.3项下的检测方法进样得到峰面积，运用建立的标准曲线换算得到探针药的浓度。

2.2 RT-PCR法测定土忍翘薇合剂对大鼠CYP450酶mRNA表达的影响

2.2.1 动物给药与取样：8只SD大鼠随机分为对照组和实验组，实验组每日灌胃6 mL/kg土忍翘薇合剂，对照组灌胃等剂量纯净水，给药持续14 d。最后一次给药后24 h处死，迅速取肝脏组织于-80 ℃冰箱保存。

2.2.2 RNA提取：按试剂盒说明书提取肝脏总RNA，于260 nm和280 nm测定吸光度，两者比值介于1.8和2.0之间视为提取的RNA纯度合格，同时根据260 nm吸光值将RNA浓度调整至1 μg/μL，用cDNA反转录试剂盒进行反转录。

2.2.3 cDNA合成：取1 μg总RNA，分别加入1 μL random hexamer primer、4 μL 5×Reaction buffer、1 μL RiboLock RNase Inhibitor、2 μL dNTP mix、1 μL RebertAid M-MuLV Transcriptase和10 μL nuclease-free water至终体积20 μL。反转录条件为25 ℃ 5 min，42 ℃ 60 min，最后70 ℃5 min终止反应，得到的cDNA产物用于PCR反应或于-20 ℃冰箱保存备用。

2.2.4 RT-PCR测定mRNA表达水平：取2 μL cDNA产物，分别加入10 μL 2×SYBR Green PCR Master Mix、20 mmol/L上下游引物各0.5 μL、7 μL nuclease-free water，使反应终体积为20 μL。PCR反应条件为：50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min，95 ℃15 s，60 ℃ 1 min，运行40个循环。测定样本CT值后，采用2-ΔΔCT法计算实验组CYP450酶基因表达相对于对照组的倍数变化。大鼠CYP1A2、CYP2B1、CYP2E1、CYP3A1和β-actin（内参）引物序列见表2。

表2 大鼠CYP450酶引物序列

2.3 统计学处理方法 采用SPSS19.0软件对数据进行统计分析。实验数据以 ±s表示，药动学参数使用DAS2.0软件计算，组间数据比较采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 土忍翘薇合剂对大鼠CYP450酶活力的影响 4种探针药和内标色谱图如图1所示，非那西丁、安非他酮、氯唑沙宗、咪达唑仑与内标地西泮及甲苯磺丁脲的保留时间分别为1.76、1.67、1.89、1.77、2.23和2.09 min。血浆中4种探针药最低检测限均为5 ng/mL，在线性范围内4种探针药日内和日间精密度相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）均小于8%，相对回收率均在95%～101%，绝对回收率均大于80%。本方法具有较高专属性，适用于同时测定大鼠血浆中4种探针药的浓度。

采集的血样运用建立的方法进行血药浓度测定，绘制平均药时曲线图和计算药动学参数，如图2与表3所示。与对照组比较，实验组大鼠连续灌胃土忍翘薇合剂14 d后，非那西丁的清除率（Clz/F）提高了42%，曲线下面积（AUC0-t）减少了31%，达峰浓度（Cmax）减少了33%（P＜0.05），说明土忍翘薇合剂对CYP1A2活力具有显著诱导作用；实验组咪达唑仑的Clz/F提高了66%，AUC0-t和Cmax分别为对照组的57%和52%，表观分布容积（Vz/F）增加了1.36倍（P＜0.05），说明土忍翘薇合剂对CYP3A1活力具有显著诱导作用；安非他酮和氯唑沙宗药时曲线图和药动学参数均提示土忍翘薇合剂对CYP2B1和CYP2E1活力无明显影响。

3.2 土忍翘薇合剂对大鼠CYP450酶mRNA表达的影响 如图3所示，实验组大鼠CYP1A2和CYP3A1 mRNA表达分别上调为对照组的2.26倍和1.94倍（P＜0.05），而CYP2B1与CYP2E1 mRNA表达2组间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

4 讨论

不同物种之间CYP450基因序列具有一定相似性，经比对，大鼠CYP1A2、CYP2B1、CYP2E1、CYP3A1与人CYP1A2、CYP2B6、CYP2E1、CYP3A4 mRNA序列分别具有70%、74%、81%、73%同源性[10]，因此这4个大鼠CYP450亚型酶变化可以作为人CYP450酶变化的参考。

观察对应底物的药动学参数可以评估CYP450酶的活力[11-13]，本研究运用前期建立的cocktail探针法，通过酶底物非那西丁、安非他酮、氯唑沙宗和咪达唑仑的药动学改变来评估大鼠CYP1A2、CYP2B1、CYP2E1、CYP3A1的酶活力变化，同时用RTPCR法测定CYP450的mRNA表达水平，从酶活力和基因表达2方面检测土忍翘薇合剂对CYP450的调控作用，结果发现，土忍翘薇合剂对CYP1A2和CYP3A1均表现出诱导作用。

图1 大鼠血浆中探针药和内标的液质检测色谱图

图2 对照组与实验组探针药的平均药时曲线图（n=6）

表3 探针药药动学参数（n=6， ±s）

图3 对照组与实验组大鼠CYP450酶mRNA表达水平比较

人体内CYP1A2主要在肝脏分布，约占CYP450总量的13%左右，负责约二十多种药物的体内代谢，包括华法林、茶碱、氯氮平和氟哌啶醇等窄治疗窗药物[14]。CYP3A4在人体内的含量和代谢药物种类均位于CYP亚酶的首位，参与约50%以上临床常用药物的生物转化，涉及大环内酯类抗生素、抗真菌药、HMG-CoA还原酶抑制剂、苯二氮卓类、质子泵抑制剂、钙通道阻滞剂等[15]。在使用以上药物治疗期间，如服用土忍翘薇方可能会加速其在体内的代谢，导致治疗效果的波动，需要密切关注。此外，土忍翘薇合剂在酶活力和基因表达水平对大鼠CYP450酶产生的诱导趋势同步，说明土忍翘薇合剂对酶活力的影响可能是通过调控mRNA表达水平来实现。

近十多年，本院一直用土忍翘薇方防治糖皮质激素的不良反应，患者获益明显。土忍翘薇方取土茯苓除湿通络利关节、忍冬藤清热解毒通经、连翘清热解毒散结及白薇清虚实两热等作用，以中医药的理论分析，本方组合符合糖皮质激素不良反应的防治思路，但如何使用现代医学理论对土忍翘薇方的药理作用进行解释，是目前面临的难题。本研究发现，土忍翘薇合剂能同时增强CYP3A1酶活力和mRNA表达，在人体内CYP3A4同时也是外源性激素（糖皮质激素）的代谢酶，CYP3A4上调可以下调体内糖皮质激素的浓度，使其对垂体分泌肾上腺皮质激素的抑制作用减弱，进而达到拮抗糖皮质激素不良反应的目的。

中药方剂成分复杂，单味中药就含有大量的活性成分，而每种成分也具有不同的药理作用，如果将中药方剂简单地作为多种单体成分的加减反应是不科学的。本研究将土忍翘薇方作为一个整体，用探针药物法和PCR法来评估其对代谢酶的影响，对于该方在临床上的合理应用，提高联合用药的安全性和有效性，促进中药基础理论的现代化研究均具有重要的意义。