白藜芦醇通过调节Ca2+浓度对小鼠外周疼痛的影响及作用机制

王林，潘建春

（1.杭州市第一人民医院 药学部，浙江 杭州 310006；2．温州医科大学 脑科学研究所，浙江 温州325035）

图1 小鼠甩尾实验中白藜芦醇和MK801对甩尾潜伏期的作用

钙离子（Ca2+）作为第二信使，参与细胞内一系列功能活动，包括电生理活性、神经递质释放、蛋白磷酸化和基因表达等[1]。有研究表明中枢Ca2+与疼痛的传递密切相关，例如通过热板实验和甩尾实验，灌胃给予L-型钙通道拮抗剂尼莫地平、硝苯地平等提高对疼痛作用的阈值[2-3]。急性或者慢性鞘内注射N-型Ca2+通道拮抗剂ω-conopeptides在热板实验同样产生疼痛作用。更进一步，有研究表明Ca2+/咖啡因敏感微粒体池、钙调蛋白、CaMKIIK参与吗啡和β-内啡肽的镇痛作用[4-6]。增加细胞内Ca2+浓度可以拮抗阿片类（包括吗啡、β-内啡肽和脑啡肽）产生的镇痛作用。注射Ca2+和Ca2+载体（如X-537A和A23187），可以把Ca2+从细胞外转移到细胞内，从而增加细胞内Ca2+浓度，减弱阿片类产生的镇痛作用[7]。相反脑内注射Ca2+螯合剂EGTA可以加强阿片类产生的镇痛作用。Ca2+极容易从N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-D-aspartic acid，NMDA）受体通道渗透进入细胞内[8]。有研究者发现在机械超敏实验和热痛觉超敏实验中白藜芦醇可以剂量依赖性翻转神经压迫疼痛[9-13]。本研究旨在探讨Ca2+是否参与白藜芦醇的镇痛作用。

1 材料和方法

1.1 药物、主要试剂及仪器 白藜芦醇购自武汉圣天宇公司，尼莫地平购自美国ENZO公司，CaCl2购自衢州巨化试剂公司，EGTA购自中国医药集团总公司，兰尼定购自英国Tocris生物科学公司，Mk801购自美国Sigma公司，小鼠固定器、脑立体定位仪和微量进样器购自深圳瑞沃德公司。

1.2 动物分组和模型制备 雄性ICR小鼠，体质量25～30 g，由中国科学院上海动物中心提供。动物许可证号：SCXK（沪）2013-0017。饲养条件：8只/笼，室温（24±1）℃，湿度（50±10）%，自然光照，昼夜节律，自由摄食饮水。所有动物适应环境5 d后开始实验，实验前禁食10 h，饮水自由。小鼠分组为白藜芦醇（10、20、40 mg/kg，p.o.）组，白藜芦醇（10 mg/kg，p.o.）联合使用MK801（0.5 mg/kg，i.p.）组、白藜芦醇（10 mg/kg，p.o.）联合使用尼莫地平（2.5、5、10 mg/kg，i.p.）组、白藜芦醇（20 mg/kg，p.o.）联合使用CaCl2（25、50、100、200 nmol/只，i.c.v.）组、白藜芦醇（10 mg/kg，p.o.）联合使用兰尼定（0.25、0.5、1、2 nmol/只，i.c.v.）组和白藜芦醇（10 mg/kg，p.o.）联合使用EGTA（5、15、30 nmol/只，i.c.v.）组，以上各剂量组每组8只小鼠。

白藜芦醇（10、20、40 mg/kg）溶解于0.5%羧甲基纤维素钠中，其他试剂溶解于0.9%氯化钠溶液，尼莫地平另外滴加一滴乙醇，使充分溶解。白藜芦醇给药30 min后，进行甩尾实验；联合用药组分别给予MK801或尼莫地平或CaCl2或兰尼定或EGTA后5 min，再给予白藜芦醇30 min后，进行甩尾实验。空白组1给予0.9%氯化钠溶液或0.5%羧甲基纤维素钠，空白组2单独给予白藜芦醇。

脑内注射给药参考文献[14]的方法，小鼠海马CA1区注射1 μL液体。小鼠麻醉后，固定好头部，27G针连接到50 μL微量进样器，进样器注射进针深度2 mm，注射1 μL液体。注射点位置在中缝线两侧2 mm，前囟点后面2 mm，注射到海马CA1区。为了验证注射点的位置，向注射位置注入10 μL 1%甲基蓝染料，进行组织学研究。

1.3 甩尾实验检测痛觉潜伏期 通过测试小鼠甩尾的潜伏期评价药物产生镇痛作用的效果，主要评价外周疼痛。将小鼠尾巴浸入水面以下3 cm，水温是（52.0±0.5）℃，小鼠受到热刺激，记录尾巴甩出水面的时间作为疼痛的阈值，为了避免产生组织损伤，截止时间为10 s。

1.4 统计学处理方法 采用SPSS16.0软件进行统计学分析。计量资料以 ±s表示，组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用Dunnett’s t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MK801对白藜芦醇镇痛作用的影响 在甩尾实验中，与空白组1比，白藜芦醇（10、20、40 mg/kg，p.o.）使小鼠甩尾的潜伏期显著延长（P＜0.01）。在白藜芦醇的不同剂量中，小鼠的甩尾潜伏期呈剂量依赖关系。预先使用MK801阻断NMDA受体通道以后，白藜芦醇的镇痛作用明显增加强（P＜0.01）。见图1。

2.2 尼莫地平对白藜芦醇镇痛作用的影响 白藜芦醇阈下剂量10 mg/kg在甩尾实验中不产生镇痛作用，但是在联合使用尼莫地平以后，白藜芦醇的镇痛作用得到明显加强（P＜0.05）。见图2。

2.3 Ca2+和EGTA对白藜芦醇镇痛作用的影响 EGTA单独使用对镇痛作用没有影响[1]，但是脑内注射EGTA以后，明显加强了白藜芦醇白藜芦醇（10 mg/kg）的镇痛作用（P＜0.05）。见图3。

2.4 兰尼定对白藜芦醇镇痛作用的影响 体外研究表明，兰尼定抑制Ca2+从细胞内钙库的释放[15-16]。兰尼定（0.25，0.5，1，2 nmol/只，i.c.v.）单独使用不产生镇痛作用或者毒性作用[6]，但是兰尼定联合使用阈下剂量白藜芦醇（10 mg/kg，p.o.）后，明显增强了白藜芦醇的镇痛作用（P＜0.01）。见图4。

3 讨论

急性给予白藜芦醇以后，对小鼠进行甩尾实验，产生了明显的镇痛作用，表现为小鼠的痛阈值明显升高（P＜0.01），这表明白藜芦醇具有镇痛作用。然后我们设计了一系列与Ca2+有关的实验，探讨白藜芦醇的镇痛作用是否与Ca2+有关。

Ca2+从细胞外转移到细胞内，可以通过NMDA受体进入细胞，它是高度通透Ca2+的[16-17]。NMDA受体通道有配体和电压门控两种独特的的门控方式，在静息电位时电压门控由Mg2+阻断离子通道，当膜去极化以后，Mg2+离去，NMDA受体通道开放，Ca2+进入细胞内。当预先给予NMDA受体拮抗剂MK801，谷氨酸无法与其受体结合，因此Mg2+无法从膜上离去，从而导致Ca2+通道处于关闭状态，细胞外Ca2+无法从这一通道进入细胞内，细胞内Ca2+减少，浓度降低，增强了白藜芦醇的镇痛作用。

给予L-型钙通道拮抗剂尼莫地平（2.5～10 mg/kg，i.p.）对小鼠不产生镇痛作用[1]，但是尼莫地平显著增强了白藜芦醇阈下剂量（10 mg/kg）的镇痛作用。L-型钙通道拮抗剂增强白藜芦醇镇痛作用的具体机制仍然不清楚。尼莫地平拮抗L-型钙通道后使细胞内Ca2+浓度降低，增强了白藜芦醇的镇痛作用。

脑内注射Ca2+减弱了白藜芦醇的镇痛作用，而注射Ca2+选择性螯合剂EGTA却增强了白藜芦醇的镇痛作用。神经元内Ca2+浓度降低会产生镇痛作用，而细胞内Ca2+浓度升高则拮抗镇痛作用[18-19]，进而我们提出白藜芦醇的镇痛作用与细胞内Ca2+浓度降低或升高有关的假设。与脑内注射Ca2+螯合剂EGTA相反，注射Ca2+直接使突触内Ca2+浓度升高，并且使神经元发挥功能[21]。在海马CA1区注射Ca2+升高细胞外Ca2+浓度，然后增加Ca2+透膜进入细胞，从而升高细胞内Ca2+浓度，阻断了白藜芦醇产生的镇痛作用。与L-型钙通道拮抗剂类似，脑内注射Ca2+选择性螯合剂EGTA，细胞外Ca2+浓度降低，能够进入细胞内的Ca2+减少，进而降低细胞内Ca2+的浓度，从而增强了白藜芦醇的镇痛作用。

图3 小鼠甩尾实验中CaCl2和EGTA对甩尾潜伏期的影响

图2 小鼠甩尾实验中尼莫地平对甩尾潜伏期的影响

图4 小鼠甩尾实验中兰尼定对甩尾潜伏期的影响

与大多数细胞相似，在神经元内Ca2+浓度不仅受从细胞外透膜进入细胞内的Ca2+调节，还受细胞内通过三磷酸肌醇和兰尼定受体影响钙库的Ca2+调节[18]。兰尼定受体在调节微粒体钙库Ca2+释放方面发挥重要作用[19]。SAEKI等[20]发现脑内兰尼定受体在仓鼠内表达始终是Ca2+和咖啡因敏感的。因此，本研究旨在探讨Ca2+从钙/咖啡因敏感池释放是否参与白藜芦醇的镇痛作用。在本研究中，脑内注射兰尼定显著增强了白藜芦醇的镇痛作用（P＜0.01）。已经有研究表明兰尼定阻断Ca2+从钙/咖啡因敏感微粒体池释放[21-23]，注射兰尼定使细胞内钙库中Ca2+的释放减少，细胞内Ca2+减少，Ca2+浓度降低，增强白藜芦醇的镇痛作用。另外兰尼定降低Ca2+从细胞外进入细胞的速率[23]。因此，兰尼定通过降低细胞内Ca2+浓度增强白藜芦醇的镇痛作用，而脑内注射Ca2+减弱了白藜芦醇的镇痛作用。

综上所述，白藜芦醇的镇痛作用可能是通过降低细胞内Ca2+浓度产生的，其具体的作用机制有待于进一步研究。