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芪茵颗粒对非酒精性脂肪性肝病大鼠FATP4、L-FABP mRNA表达的影响

2018-02-06曾斌芳乔治园

新疆医科大学学报 2018年2期
关键词:酒精性脂肪肝空白对照

王 洁, 曾斌芳, 杨 旋, 乔治园

(新疆医科大学中医学院, 乌鲁木齐 830011)

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是一种以遗传因素、胰岛素抵抗、脂代谢紊乱为主要特征的代谢性应激引起的肝损伤,除患者无过量饮酒史外,NAFLD与酒精性肝病(ALD)的病理变化相似,包括非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、非酒精性单纯性脂肪肝( NAFL)、NASH相关肝硬化(LC)和肝细胞癌(HCC)[1],NAFLD已严重威胁到人类的健康,但此病成因复杂,且发病机制尚不完全清楚,故许多理论尚处于假说阶段,Day[2]提出的二次打击理论是1988年至今最具影响力的理论。本课题前期研究表明[3-4],芪茵颗粒能明显改善NAFLD患者肝功能,体质指数(BMI)、血清中谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST);血脂中高密度脂蛋白(HDL-c)、低密度脂蛋白(LDL-c)、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)等指标,未发现明显不良反应,但其作用机制尚不清楚。本研究拟通过观察芪茵颗粒对 NAFLD大鼠肝组织中肝脏脂肪酸转运蛋白(FATP4)、肝脏脂肪酸结合蛋白(L-FABP) mRNA表达的影响,对NAFLD的治疗作用机制进行进一步探讨。

1 材料与方法

1.1实验动物雄性SD大鼠72只,体质量180~220 g,购买自新疆医科大学第一附属医院科技楼实验动物中心,实验动物批准文号:SCXK(新)2014-0011。

1.2药物与饲养芪茵颗粒免煎剂(由生黄芪、茵陈、补骨脂、生山楂、泽泻、决明子、生大黄、三七粉、苦丁茶等组成),购于新疆医科大学附属中医医院(由江苏天江药业提供),用温水混合芪茵颗粒,煎煮5 min,生药浓度1 g/mL。正常饲料(碳水化合物60.5%+脂肪13.8%+蛋白质25.7%),高脂乳剂(猪油30 g、吐温10 mL,丙二醇10 mL、胆固醇10 g、猪胆酸3 g、加蒸馏水至100 mL)。

1.3试剂与仪器总RNA提取试剂盒(生产批号:00R6834010000L12P023,奥格生物技术有限公司);反转录试剂盒(生产批号:00435083,北京赛默飞世尔科技公司);引物由上海生物工程公司提供;垂直电泳仪(型号:Mini-PROTEAN Tetra);核酸定量仪(型号:ND-1000),PCR仪(型号:C1000),BIO-RAD实时荧光定量PCR仪;凝胶成像分析系统(型号:GELDOC XR+)。

1.4实验方法

1.4.1 造模与分组 雄性SD大鼠72只,适应性喂养1 w后,随机分为模型组、空白对照组、芪茵颗粒低、中、高剂量组和阳性药物硫普罗宁组,每组各12只,除空白对照予以常规饲养外,其余5组用灌胃高脂乳剂造模,每日1次,每次10 mL/kg体质量,持续灌胃10 w,第10 周末随机在各组间抽取大鼠2只,对12只大鼠进行肝脏病理切片的制作,观察肝脏组织病理学变化,确立NAFLD模型是否成功。

1.4.2 给药 确定造模成功,各组大鼠饮食恢复正常,空白对照组和模型组予10 mL/kg体质量蒸馏水灌胃,芪茵颗粒低、中、高剂量组分别按2.5、5、10 g/kg体质量灌胃,阳性药物硫普罗宁组按20 mg/kg体质量灌胃,时间均为10 w。

1.4.3 样本采集与检测 末次给药后12 h,大鼠禁食不禁水,测体质量并记录,10%的水合氯醛(3 mL/kg体质量)对大鼠进行腹腔注射麻醉,快速开腹,准确找到腹主动脉,普通生化管采血4 mL,静置于室温下2 h后3 500 r/min离心10 min,分离出血清,分装至1.5 mL离心管中,于-20℃冰箱中保存备用。大鼠开腹后,小心分离出完整肝脏,称重并记录,-80℃冰箱冷冻保存备用。

1.4.4 指标的检测 采用全自动生化分析仪检测血脂HDL-c、LDL-c、TC、TG和血清ALT、AST的含量。肝脏FATP4、L-FABP mRNA基因表达量检测:取肝组织30 mg,用Trizol法,提取总RNA,纯度和含量用核酸定量仪测定,mRNA的OD260/OD280数值为1.8~2.1最佳, mRNA反转录成 cDNA,PCR扩增以β-actin为内参(表1);FATP4、L-FABP反应条件(内参同):94℃变性4 min,退火(94℃20 s,56℃30 s),72℃延伸30 s,30个循环,72℃继续延伸10 min。

表1 各基因引物序列及其产物长度

2 结果

2.1各组大鼠血清ALT、AST水平的比较与空白对照组相比,模型组大鼠血清ALT、AST含量显著升高,差异有统计学意义(P<0.01);与模型组相比,芪茵颗粒高、中剂量组血清ALT、 AST水平明显降低, 差异有统计学意义(P<0.01);与硫普罗宁组相比,芪茵颗粒低、中、高剂量组血清 ALT、 AST水平均降低,其中芪茵颗粒高剂量组ALT、 AST水平降低更为显著,差异有统计学意义(P<0.05~0.01),见表2。

表2 各组大鼠血清ALT、AST水平的比较

注:与空白对照组比较,*P<0.05,**P<0.01;与模型组比较,▲P<0.05,▲▲P<0.01;与硫普罗宁组比较,△P<0.05,△△P<0.01。

2.2各组大鼠肝血清HDL-c、LDL-c水平的比较与空白对照组相比,模型组大鼠 LDL-c明显上升,HDL-c明显下降,差异有统计学意义(P<0.01);与模型组相比,芪茵颗粒高、中剂量组 LDL-c含量明显下降,HDL-c含量明显上升,差异有统计学意义(P<0.01);与硫普罗宁组相比,芪茵颗粒高、中剂量组 LDL-c含量明显下降,HDL-c含量明显上升,差异有统计学意义(P<0.05~0.01),见表3。

表3 各组大鼠 HDL-c、LDL-c 水平的比较

注:与空白对照组比较,*P<0.05,**P<0.01;与模型组比较,▲P<0.05,▲▲P<0.01;与硫普罗宁组比较,△P<0.05,△△P<0.01。

2.3各组大鼠肝血清TC、TG水平的比较与空白对照组相比,模型组、芪茵颗粒低剂量组、硫普罗宁组TC、TG含量明显上升,差异有统计学意义(P<0.05~0.01);与模型组相比,芪茵颗粒高、中剂量组、硫普罗宁组TC、TG含量明显下降,差异有统计学意义(P<0.05~0.01);与硫普罗宁组相比,芪茵颗粒高、中剂量组TC、 TG含量明显下降,差异有统计学意义(P<0.05~0.01),见表4。

2.4各组大鼠肝脏组织FATP4、L-FABPmRNA基因表达水平的比较各组大鼠肝组织 FATP4、L-FABP mRNA含量的表达差异均有统计学意义(F=23.537、F=19.955,P均<0.05)。与空白对照组相比,模型组的表达增高,芪茵颗粒中、高剂量组表达降低,差异有统计学意义(P<0.05~0.01);与模型组相比,芪茵颗粒高、中、低剂量组表达均降低,差异有统计学意义(P<0.05~0.01);与硫普罗宁组比较,芪茵颗粒高、中剂量组表达均降低,差异有统计学意义(P<0.05~0.01),见表5。

表4 各组大鼠TC、TG 水平的比较

注:与空白对照组比较,*P<0.05,**P<0.01;与模型组比较,▲P<0.05,▲▲P<0.01;与硫普罗宁组比较,△P<0.05,△△P<0.01。

表5 各组大鼠肝脏组织FATP4、L-FABP mRNA基因表达水平的比较

注:与空白对照组比较,*P<0.05,**P<0.01;与模型组比较,▲P<0.05,▲▲P<0.01;与硫普罗宁组比较,△P<0.05,△△P<0.01。

3 讨论

随着国人生活水平的提高,脂肪肝患病率逐年上升且渐趋低龄化,当前日益增多的脂肪肝主要为非酒精性脂肪性肝病(NAFLD),NAFLD已成为我国最常见的肝脏疾病,且发病率逐年上升, 在肥胖人群中发病率高达75%[5],有研究表明[6]: NAFLD主要病理机制是肥胖、高脂血症等因素导致 IR及肝细胞脂肪变性,脂质代谢异常是其最重要和最基础的环节之一,探讨中医药对脂质代谢异常的治疗机制,对 NAFLD的治疗有重要意义。

L-FABP是FABP家族中的一员,其分子量较低;FATP4是FATP家族中的一员,是一种结构完整的细胞膜蛋白;二者大量分布于肝细胞和小肠黏膜细胞的胞浆中,为长链脂肪酸与极长链脂肪酸的摄取和转运提供帮助, 并在脂肪酸代谢中起中心调节作用,与 NAFLD关系密切[7-9]。在脂质代谢紊乱加重时,血浆中的游离脂肪酸及 TG含量也逐渐增加,与L-FABP和FATP变化同步,提示L-FABP与 FATP参与调节大鼠的脂肪酸代谢[10],因此,L-FABP与 FATP在 NAFLD的发展进程及脂质代谢紊乱中起到了重要作用。临床上常用肝脏血清 ALT、AST 反映肝脏功能,脂肪肝形成后严重影响肝脏功能,血清ALT、AST 活性也随之显著增强[11]。

芪茵颗粒是新疆医科大学附属中医医院院内协定处方,根据非酒精性脂肪肝“肝脾肾同调,痰瘀滞同治” 的创新理论组方,针对脾肾两虚,痰瘀互结的病机关键,以虚湿瘀滞并治,肝脾肾同调为主要治则。芪茵颗粒方中以生黄芪、茵陈二者为君,补脾胃同时亦可清肝之湿热;以三七粉、决明子二者为臣,祛瘀化浊,清热解郁;补骨脂、生大黄、生山楂、泽泻四药共佐,祛瘀兼以补肝肾;苦丁茶为使,化痰清热、化积消脂。组方精良,有良好的调理肝、脾、肾功能,有助消化、祛湿、活血作用[12-14]。

本研究通过持续10 w的高脂乳剂灌胃建立大鼠 NAFLD模型,在造模第10周形成非酒精性脂肪肝,表明恒久大量的高脂饮食可能会引起脂质代谢紊乱,形成 NAFLD,脂质代谢紊乱可能是 NAFLD形成的一个重要环节。造模成功后予芪茵颗粒治疗,结果显示与空白对照组相比,模型组大鼠 LDL-c明显上升,HDL-c明显下降, TC、TG 含量明显上升,血清ALT、AST含量显著升高,肝组织FATP4、L-FABP mRNA含量的表达增高,差异有统计学意义(P<0.05~0.01);经芪茵颗粒治疗后,与模型组相比,芪茵颗粒高、中剂量组LDL-c含量明显下降,HDL-c含量明显上升,TC、TG含量明显下降,血清 ALT、 AST水平明显降低,芪茵颗粒高、中、低剂量组肝组织FATP4、 L-FABP mRNA含量的表达均降低,差异有统计学意义(P<0.05~0.01)。表明芪茵颗粒治疗 NAFLD作用机制之一是抑制肝组织中 FATP4、 L-FABP mRNA的表达,通过调节脂代谢紊乱达到对NAFLD良好的治疗效果,以上研究结果可为非酒精性脂肪肝的治疗提供实验依据。

[1] 中华医学会肝病学分会脂肪肝和酒精性肝病学组.非酒精性肝病诊疗指南(2010年修订版)[J].中华肝脏病杂志,2010,19(6):483-487.

[2] DAY C P. Non-alcoholic fatty liver disease:a massive problem[J].Clin Med, 2011,11(2): 176-178.

[3] 张金颖,曾斌芳.芪茵颗粒治疗酒精性脂肪肝的临床疗效分析[J].新疆中医药杂志,2008,26(2):19-20.

[4] 赵智宏,王转国,陈俊玲,等.芪茵茶治疗非酒精性脂肪肝(肝郁脾虚型)56例临床观察[J].云南中医中药杂志,2010,31(5):21-22.

[5] 薛黎,孟存仁,刘继文.乌鲁木齐市健康体检人群非酒精性脂肪性肝病患病状况调查[J].新疆医科大学学报,2009,32(9):1346-1349.

[6] TANG W, ZENG L, YIN J, et al. Hugan Qingzhi exerts anti-inflammatory effects in a rat model of nonalcoholic fatty liverdisease[J]. Evid Based Complement Alternat Med, 2015, 2015(1):1-13.

[7] 冯爱娟, 陈东风. 肝细胞L-FABP、FATP4在大鼠非酒精性脂肪性肝病形成中的表达及意义[J]. 中华肝脏病杂志, 2005,13(10):776-779.

[8] GOLABI P, LOCKLEAR C T, AUSTIN P, et al. Effectiveness of exercise in hepatic fat mobilization in non-alcoholic fatty liver disease:Systematic review [J]. World J Gastroenterol, 2016, 22(27):6318-6327.

[9] LIN Z, CAI F, LIN N, et al. Effects of glutamine on oxidative stress and nuclear factor-kappaB expression in the livers of rats with nonalcoholic fatty liver disease[J].Exp Ther Med, 2014, 7(2):365-370.

[10] ZENG L, TANG W J, YIN J J, et al. Signal transductions and nonalcoholic fatty liver: a mini-review[J]. Int J Clin Exp Med, 2014, 7(7):1624-1631.

[11] 张介眉,时昭红,郑娅琼,等.葱神清脂软胶囊对非酒精性脂肪肝大鼠氧化损伤的保护作用[J].中国中西医结合消化杂志,2009, 17(4):217-220.

[12] 郭峰,刘阳军,曾斌芳.芪茵颗粒治疗非酒精性脂肪肝大鼠的实验研究[J]. 新疆中医药, 2008,26(3):30-32.

[13] 郭红梅,曾斌芳.芪茵颗粒对非酒精性脂肪肝大鼠瘦素及胰岛素抵抗的影响[J]. 新疆中医药, 2008,26(3):33-34.

[14] 刘阳军,郭峰,曾斌芳.芪茵颗粒治疗非酒精性脂肪性肝病(肝郁脾虚型)临床研究[J].新疆中医药,2008,26(3):8-10.

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