芪茵颗粒对非酒精性脂肪性肝病大鼠FATP4、L-FABP mRNA表达的影响

王 洁, 曾斌芳, 杨 旋, 乔治园

(新疆医科大学中医学院， 乌鲁木齐 830011)

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是一种以遗传因素、胰岛素抵抗、脂代谢紊乱为主要特征的代谢性应激引起的肝损伤，除患者无过量饮酒史外，NAFLD与酒精性肝病(ALD)的病理变化相似，包括非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、非酒精性单纯性脂肪肝( NAFL)、NASH相关肝硬化(LC)和肝细胞癌(HCC)[1]，NAFLD已严重威胁到人类的健康，但此病成因复杂，且发病机制尚不完全清楚，故许多理论尚处于假说阶段，Day[2]提出的二次打击理论是1988年至今最具影响力的理论。本课题前期研究表明[3-4]，芪茵颗粒能明显改善NAFLD患者肝功能，体质指数(BMI)、血清中谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)；血脂中高密度脂蛋白(HDL-c)、低密度脂蛋白(LDL-c)、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)等指标，未发现明显不良反应，但其作用机制尚不清楚。本研究拟通过观察芪茵颗粒对 NAFLD大鼠肝组织中肝脏脂肪酸转运蛋白(FATP4)、肝脏脂肪酸结合蛋白(L-FABP) mRNA表达的影响，对NAFLD的治疗作用机制进行进一步探讨。

1 材料与方法

1.1实验动物雄性SD大鼠72只，体质量180～220 g，购买自新疆医科大学第一附属医院科技楼实验动物中心，实验动物批准文号：SCXK(新)2014-0011。

1.2药物与饲养芪茵颗粒免煎剂(由生黄芪、茵陈、补骨脂、生山楂、泽泻、决明子、生大黄、三七粉、苦丁茶等组成)，购于新疆医科大学附属中医医院(由江苏天江药业提供),用温水混合芪茵颗粒，煎煮5 min，生药浓度1 g/mL。正常饲料(碳水化合物60.5%+脂肪13.8%+蛋白质25.7%)，高脂乳剂(猪油30 g、吐温10 mL，丙二醇10 mL、胆固醇10 g、猪胆酸3 g、加蒸馏水至100 mL)。

1.3试剂与仪器总RNA提取试剂盒(生产批号:00R6834010000L12P023，奥格生物技术有限公司)；反转录试剂盒(生产批号：00435083，北京赛默飞世尔科技公司)；引物由上海生物工程公司提供；垂直电泳仪(型号：Mini-PROTEAN Tetra)；核酸定量仪(型号：ND-1000)，PCR仪(型号：C1000)，BIO-RAD实时荧光定量PCR仪；凝胶成像分析系统(型号：GELDOC XR+)。

1.4实验方法

1.4.1 造模与分组 雄性SD大鼠72只，适应性喂养1 w后，随机分为模型组、空白对照组、芪茵颗粒低、中、高剂量组和阳性药物硫普罗宁组，每组各12只，除空白对照予以常规饲养外，其余5组用灌胃高脂乳剂造模，每日1次，每次10 mL/kg体质量，持续灌胃10 w，第10 周末随机在各组间抽取大鼠2只，对12只大鼠进行肝脏病理切片的制作，观察肝脏组织病理学变化，确立NAFLD模型是否成功。

1.4.2 给药 确定造模成功，各组大鼠饮食恢复正常，空白对照组和模型组予10 mL/kg体质量蒸馏水灌胃，芪茵颗粒低、中、高剂量组分别按2.5、5、10 g/kg体质量灌胃，阳性药物硫普罗宁组按20 mg/kg体质量灌胃，时间均为10 w。

1.4.3 样本采集与检测 末次给药后12 h，大鼠禁食不禁水，测体质量并记录，10%的水合氯醛(3 mL/kg体质量)对大鼠进行腹腔注射麻醉，快速开腹，准确找到腹主动脉，普通生化管采血4 mL，静置于室温下2 h后3 500 r/min离心10 min，分离出血清，分装至1.5 mL离心管中，于-20℃冰箱中保存备用。大鼠开腹后，小心分离出完整肝脏，称重并记录，-80℃冰箱冷冻保存备用。

1.4.4 指标的检测 采用全自动生化分析仪检测血脂HDL-c、LDL-c、TC、TG和血清ALT、AST的含量。肝脏FATP4、L-FABP mRNA基因表达量检测：取肝组织30 mg，用Trizol法，提取总RNA，纯度和含量用核酸定量仪测定，mRNA的OD260/OD280数值为1.8～2.1最佳， mRNA反转录成 cDNA，PCR扩增以β-actin为内参(表1)；FATP4、L-FABP反应条件(内参同)：94℃变性4 min,退火(94℃20 s,56℃30 s)，72℃延伸30 s,30个循环，72℃继续延伸10 min。

表1 各基因引物序列及其产物长度

2 结果

2.1各组大鼠血清ALT、AST水平的比较与空白对照组相比，模型组大鼠血清ALT、AST含量显著升高，差异有统计学意义(P<0.01)；与模型组相比，芪茵颗粒高、中剂量组血清ALT、 AST水平明显降低， 差异有统计学意义(P<0.01)；与硫普罗宁组相比，芪茵颗粒低、中、高剂量组血清 ALT、 AST水平均降低，其中芪茵颗粒高剂量组ALT、 AST水平降低更为显著，差异有统计学意义(P<0.05～0.01),见表2。

表2 各组大鼠血清ALT、AST水平的比较

注：与空白对照组比较,*P<0.05,**P<0.01；与模型组比较,▲P<0.05,▲▲P<0.01；与硫普罗宁组比较，△P<0.05,△△P<0.01。

2.2各组大鼠肝血清HDL-c、LDL-c水平的比较与空白对照组相比，模型组大鼠 LDL-c明显上升，HDL-c明显下降，差异有统计学意义(P<0.01)；与模型组相比，芪茵颗粒高、中剂量组 LDL-c含量明显下降，HDL-c含量明显上升，差异有统计学意义(P<0.01)；与硫普罗宁组相比，芪茵颗粒高、中剂量组 LDL-c含量明显下降，HDL-c含量明显上升，差异有统计学意义(P<0.05～0.01)，见表3。

表3 各组大鼠 HDL-c、LDL-c 水平的比较

注：与空白对照组比较,*P<0.05,**P<0.01；与模型组比较,▲P<0.05,▲▲P<0.01；与硫普罗宁组比较，△P<0.05,△△P<0.01。

2.3各组大鼠肝血清TC、TG水平的比较与空白对照组相比，模型组、芪茵颗粒低剂量组、硫普罗宁组TC、TG含量明显上升，差异有统计学意义(P<0.05～0.01)；与模型组相比，芪茵颗粒高、中剂量组、硫普罗宁组TC、TG含量明显下降，差异有统计学意义(P<0.05～0.01)；与硫普罗宁组相比，芪茵颗粒高、中剂量组TC、 TG含量明显下降，差异有统计学意义(P<0.05～0.01)，见表4。

2.4各组大鼠肝脏组织FATP4、L-FABPmRNA基因表达水平的比较各组大鼠肝组织 FATP4、L-FABP mRNA含量的表达差异均有统计学意义(F=23.537、F=19.955，P均<0.05)。与空白对照组相比，模型组的表达增高，芪茵颗粒中、高剂量组表达降低，差异有统计学意义(P<0.05～0.01)；与模型组相比，芪茵颗粒高、中、低剂量组表达均降低，差异有统计学意义(P<0.05～0.01)；与硫普罗宁组比较，芪茵颗粒高、中剂量组表达均降低，差异有统计学意义(P<0.05～0.01)，见表5。

表4 各组大鼠TC、TG 水平的比较

注：与空白对照组比较,*P<0.05,**P<0.01；与模型组比较,▲P<0.05,▲▲P<0.01；与硫普罗宁组比较，△P<0.05,△△P<0.01。

表5 各组大鼠肝脏组织FATP4、L-FABP mRNA基因表达水平的比较

注：与空白对照组比较,*P<0.05,**P<0.01；与模型组比较,▲P<0.05,▲▲P<0.01；与硫普罗宁组比较，△P<0.05,△△P<0.01。

3 讨论

随着国人生活水平的提高，脂肪肝患病率逐年上升且渐趋低龄化，当前日益增多的脂肪肝主要为非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)，NAFLD已成为我国最常见的肝脏疾病，且发病率逐年上升， 在肥胖人群中发病率高达75%[5]，有研究表明[6]： NAFLD主要病理机制是肥胖、高脂血症等因素导致 IR及肝细胞脂肪变性，脂质代谢异常是其最重要和最基础的环节之一，探讨中医药对脂质代谢异常的治疗机制，对 NAFLD的治疗有重要意义。

L-FABP是FABP家族中的一员，其分子量较低；FATP4是FATP家族中的一员，是一种结构完整的细胞膜蛋白；二者大量分布于肝细胞和小肠黏膜细胞的胞浆中，为长链脂肪酸与极长链脂肪酸的摄取和转运提供帮助， 并在脂肪酸代谢中起中心调节作用，与 NAFLD关系密切[7-9]。在脂质代谢紊乱加重时，血浆中的游离脂肪酸及 TG含量也逐渐增加，与L-FABP和FATP变化同步，提示L-FABP与 FATP参与调节大鼠的脂肪酸代谢[10]，因此，L-FABP与 FATP在 NAFLD的发展进程及脂质代谢紊乱中起到了重要作用。临床上常用肝脏血清 ALT、AST 反映肝脏功能，脂肪肝形成后严重影响肝脏功能，血清ALT、AST 活性也随之显著增强[11]。

芪茵颗粒是新疆医科大学附属中医医院院内协定处方，根据非酒精性脂肪肝“肝脾肾同调，痰瘀滞同治” 的创新理论组方，针对脾肾两虚，痰瘀互结的病机关键，以虚湿瘀滞并治，肝脾肾同调为主要治则。芪茵颗粒方中以生黄芪、茵陈二者为君，补脾胃同时亦可清肝之湿热；以三七粉、决明子二者为臣，祛瘀化浊，清热解郁；补骨脂、生大黄、生山楂、泽泻四药共佐，祛瘀兼以补肝肾；苦丁茶为使，化痰清热、化积消脂。组方精良，有良好的调理肝、脾、肾功能，有助消化、祛湿、活血作用[12-14]。

本研究通过持续10 w的高脂乳剂灌胃建立大鼠 NAFLD模型，在造模第10周形成非酒精性脂肪肝，表明恒久大量的高脂饮食可能会引起脂质代谢紊乱，形成 NAFLD，脂质代谢紊乱可能是 NAFLD形成的一个重要环节。造模成功后予芪茵颗粒治疗，结果显示与空白对照组相比，模型组大鼠 LDL-c明显上升，HDL-c明显下降， TC、TG 含量明显上升，血清ALT、AST含量显著升高，肝组织FATP4、L-FABP mRNA含量的表达增高，差异有统计学意义(P<0.05～0.01)；经芪茵颗粒治疗后，与模型组相比，芪茵颗粒高、中剂量组LDL-c含量明显下降，HDL-c含量明显上升，TC、TG含量明显下降，血清 ALT、 AST水平明显降低，芪茵颗粒高、中、低剂量组肝组织FATP4、 L-FABP mRNA含量的表达均降低，差异有统计学意义(P<0.05～0.01)。表明芪茵颗粒治疗 NAFLD作用机制之一是抑制肝组织中 FATP4、 L-FABP mRNA的表达，通过调节脂代谢紊乱达到对NAFLD良好的治疗效果，以上研究结果可为非酒精性脂肪肝的治疗提供实验依据。

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