卤代二甲氧基查尔酮的合成及体外抗宫颈癌活性研究

廖波儿， 杨 争， 木合布力·阿布力孜， 任丙昭， 杨旭超

(新疆医科大学药学院药物化学有机教研室， 乌鲁木齐 830011)

宫颈癌发病率近年来在我国有大幅度上升趋势。2007-2011年宫颈癌的发病率增加15.6%，增长速率排到各类癌症发病率的第一位[1]。近年来随着生活习惯以及环境影响，宫颈癌患者中年轻女性所占比例大幅攀升[2-3]。目前治疗宫颈癌的化疗药物主要以顺铂、卡铂为主，但通常顺铂注射剂又存在较多的毒副作用[4]，从自然界中植物中筛选选药物,具有毒性低、抗癌活性显著等优点。查尔酮植物中广泛存在，具有抗糖尿病[5]、抗肿瘤[6]、抗高血压[7]、抗逆转录病毒[8]、抗炎[9]、抗组胺[10]、抗氧化[11]、抗疟疾[12]等多种生物活性。本课题组前期研究发现，3-甲氧基异甘草素在进行体外抗人子宫癌细胞活性研究时表现出较好的生物活性[13]。本研究以2,4-二甲氧基苯乙酮(1)和4-氯苯甲醛(2),4-氟苯甲醛(3),4-溴苯甲醛(4)为原料，经Claisen-Schmidt 反应，得到3种卤代查尔酮(6a-6c,Scheme 1)，产率73%～85%，各化合物的结构经1H-NMR,13C-NMR进行表征；将化合物Ⅰ～Ⅲ通过MTT法进行人子宫癌SiHa和HeLa细胞增殖的体外抑制活性进行测定，为查尔酮药物的设计及细胞活性测定研究提供一定理论证据。

1 仪器与材料

1.1仪器2F-2C型暗箱式自动紫外分析仪(上海安亭电子仪器厂)，PS-1000型磁力搅拌水浴锅(Tokyo Rikaxikai)，WRX-4 显微熔点仪(宁波科诚仪器有限公司)， VarianINOVA- 400 型核磁共振仪(CDCl3为溶剂， TMS 为内标) CO2孵育箱(德国Heraeus公司)，THERMO 生物安全柜(美国thermo scientific公司)，AD340酶标分析仪(美国Beckmann公司)，HHW-420型水浴锅(深圳博大生物技术有限公司)，EPICS-XL/XL-MCL流式细胞仪(美国Beckmann公司)，BA210倒置显微镜(德国Motic公司)，Allegra-64R台式高速低温离心机(美国Beckmann公司)。

1.2试药与细胞2,4-二甲氧基苯乙酮、4-氟苯甲醛、4-氯苯甲醛、 4-溴苯甲醛(北京百灵威科技有限公司)，氢氧化钾、无水乙醇、石油醚、乙酸乙酯、丙酮(天津市富宇精细化工有限公司)，Merck薄层层析硅胶板(德国默克公司)，柱层析硅胶(青岛海洋化工厂分厂)。SiHa和HeLa细胞(中国科学院上海生命科学研究所)。

2 方法与结果

2.1合成方法采用EtOH/KOH法，将4-氟苯甲醛、4-氯苯甲醛、4-溴苯甲醛和2,4-二甲氧基苯乙酮作为反应原料，以KOH为催化剂，无水乙醇做溶剂进行Claisen-Schmidt缩合反应，合成3种4-卤代-2′,4′-二甲氧基查尔酮。

2.2合成操作化合物Ⅰ～Ⅲ的合成：依次加入5 mmol 2,4-二甲氧基苯乙酮、卤代苯甲醛6 mmol于100 mL的三颈瓶中，再加入50 mL的无水乙醇用超声溶解，然后置于磁力锅进行搅拌10 min，在称取15 mmol KOH,将称好的KOH用5 mL 50%乙醇溶液溶解，并置入4℃冰箱里10 min，然后将冷却好的KOH乙醇用逐滴缓慢滴入三颈瓶中，滴完后，化合物Ⅰ～Ⅲ反应结束时用时分别为3、5、8 h(TLC监测)，再用1 mol/L HCl溶液将反应溶液调成弱酸性，将产生的产物用布氏漏斗进行过滤，将过滤得到固体在室温下避光干燥，然后用无水乙醇进行重结晶。分别得到化合物Ⅰ：淡黄色固体结晶产率85.35%，熔点89～90℃；化合物Ⅱ：淡黄色松茸状结晶产率78.42%，熔点119℃；化合物Ⅲ：黄色结晶，产率77.88%，熔点122～124℃。

2.3体外抗肿瘤活性研究

2.3.1 细胞培养 用10%的胎牛血清，1%的双抗和DMEM配制成完全培养基，将SiHa和HeLa细胞置入含有5 mL的透气培养瓶，放置到5%CO2的37℃恒温培养箱进行培养。24 h进行传代一次。

2.3.2 样品溶液制备 用0.2 mL的DMSO溶解合成的目标化合物10 mg，再加入0.8 mL的无水乙醇，得到1 mL的10 mg/mL的母液，然后采用梯度稀释依次配制成浓度为0.01、0.1、1、 10、 50、100 μg/mL的样品溶液作为药物干预组。

2.3.3 MTT测定增殖活性 观察细胞，选择生长对数期的SiHa和HeLa细胞接种到96孔板，每孔加入浓度105/mL细胞混悬液200 μL，培养24 h后进行给药。其中将含有1%乙醇(DMSO 含0.25%)DMEM血清细胞培养液作为阴性对照组，含有10 μg/mL顺铂注射液DMEM血清细胞培养液作为阳性对照组。药物干预组采用0.01、0.1、1、10、 50、100 μg/mL的样品溶液。对SiHa和HeLa细胞作用24、48、72 h后测定OD值(570 nm)，计算细胞抑制率。

2.4目标化合物结构鉴定

2.4.1 化合物Ⅰ (E)-1-(2,4-dimethoxyphenyl)-3-(4-fluorophenyl)prop-2-en-1-one(4-氟-2′,4′-二甲氧基查尔酮)针状淡黄色晶体，熔点89～90℃，不溶于水，易溶于无水乙醇，丙酮，乙酸乙酯。1H-NMR(600MHz, CDCl3): δ 7.77 (d,J=8.6 Hz, 1H,Ar-H), 7.62 (d,J=15.8 Hz, 1H, C=C-H), 7.52 (d,J=9.0 Hz,2H,Ar-H), 7.48 (d, 1H, H-C=C),7.36 (d,J=9.0 Hz, 2H, Ar-H), 7.25 (s, 1H,Ar-H),6.57 (dd,J=6.0 Hz,1H,Ar-H),6.50(d,J=1.8, 1H,Ar-H), 3.91 (s, 3H,-OCH3), 3.87 (s, 3H,OCH3);13C-NMR (150MHz, CDCl3): δ 206.86 (C=O), 189.99, 164.29, 160.42, 140.28, 135.64, 133.96, 132.92, 132.91, 129.35, 129.01, 127.59, 121.95, 105.24, 98.58, 55.72 (-OCH3), 55.51 (-OCH3)。

2.4.2 化合物Ⅱ (E)-3-(4-chlorophenyl)-1-(2,4-dimethoxyphenyl)prop-2-en-1-one(4-氯-2′,4′-二甲氧基查尔酮) 淡黄色固体松茸状结晶，熔点119℃，不溶于水，易溶于无水乙醇，丙酮，乙酸乙酯。1H-NMR(600MHz, CDCl3): δ 7.76 (d,J=8.6 Hz, 1H, Ar-H), 7.64 (d,J=15.8 Hz, 1H, C=C-H), 7.58 (dd,J=8.6, 2H,Ar-H), 7.45 (d,J=15.8 Hz, 1H, H-C=C), 7.08 (t,J=8.6 Hz, 2H, Ar-H), 6.57 (dd,J=8.6, 2.3 Hz, 1H, Ar-H), 6.50 (s, 1H, Ar-H), 3.91 (s, 3H, OCH3), 3.87 (s, 3H, OCH3);13C-NMR (150MHz, CDCl3): δ 206.93 (C=O), 164.21, 160.37, 140.57, 132.85, 131.64, 130.03, 126.85, 122.02, 115.94, 115.79, 105.21, 98.57, 55.70 (-OCH3), 55.50(-OCH3)。

2.4.3 化合Ⅲ (E)-3-(4-bromophenyl)-1-(2,4-dimethoxyphenyl)prop-2-en-1-one(4-溴-2′,4′-二甲氧基查尔酮)针状淡黄色结晶，熔点122～124℃，不溶于水，易溶于无水乙醇，丙酮，乙酸乙酯。1H-NMR(600MHz, CDCl3): δ 7.77 (dd,J=11.0, 8.7 Hz, 1H, Ar-H), 7.62 (d,J=15.8 Hz, 1H, C=C-H), 7.52 (d,J=9.0 Hz ,2H,Ar-H), 7.46 (m, 2H, Ar-H), 6.88 (m, 1H, Ar-H), 6.58 (dd,J=8.6, 2.3 Hz, 1H,Ar-H), 6.53 (s, 1H,Ar-H),6.47 (s, 1H,Ar-H), 3.92 (s, 3H, OCH3), 3.89 (s, 3H, OCH3);13C-NMR (150MHz, CDCl3): δ 140.40 (C=O), 134.38, 133.08, 132.94, 131.99, 130.94, 129.60, 127.66, 124.01, 121.91, 105.25, 98.58, 97.86, 55.72(-OCH3), 55.49 (-OCH3), 55.02(-OCH3)。

2.4 4 3种化合物对HeLa和SiHa细胞抑制率 将3种4-卤代-2′,4′-二甲氧基查尔酮对人子宫癌HeLa和SiHa细胞作用24、48、 72 h后采用MTT法测定抑制率，测得当药物浓度为50～100 μg/mL时，对HeLa和SiHa抑制率在11.34%～95.28%。测定结果对比发现在作用相同的时间和浓度，化合物I对HeLa和SiHa细胞展现更强抑制效果，当药物浓度为50 μg/mL时，作用时间为24 h时对人宫颈癌HeLa细胞增殖的抑制率为43.15%，作用48 h时为72.32%， 72 h时为76.34%。对人子宫癌SiHa细胞作用24 h增殖的抑制率为48.43%,作用48 h为93.58%，作用72 h为94.17%，呈现出明显时间依赖性。当化合物I对人子宫癌HeLa细胞作用24 h时，药物浓度为10～100 μg/mL时，对人子宫癌HeLa细胞增殖的抑制率分别为19.05%、43.15%、61.25%，对人子宫癌SiHa细胞增殖的抑制率分别为5.55%、48.43%、77.45%，呈现出明显的浓度依赖性，见表1～2。

3 讨论

查尔酮在自然界植物中广泛存在，且具有多种生物活性，结构相对较简单容易修饰，从而成为研究热点。本课题组在前期研究中发现含有甲氧基类查尔酮化合物明显高于不含甲氧基查尔酮类化合物[14]，查尔酮类化合物在B环上带有卤素等吸电子基团，可以提高药物活性[15]。本研究根据这些构效关系研究信息设计合成3种4-卤代-2′,4′-二甲氧基查尔酮类化合物，并通过体外抗宫颈癌癌活性实验来验证药物设计的准确性。

本研究合成中采用乙醇KOH法来进行合成实验，合成后，目标化合物产率较高，3种目标查尔酮化合物产率均在70%以上。采用重结晶法对目标产物进行纯化，得到针状淡黄色结晶，纯度较高，各目标化合物的纯化条件简单，产品易得，产量较高。相较于传统柱层析法具有显著的优势。在合成反应中，对工艺做了优化，即通过反复试验，将2种反应物(酮/醛)比例调整为1∶1.2时，粗品纯度较高，再将粗品在70℃用无水乙醇中重结晶，就可以得到产率较高的纯品，可避免采用耗费耗时的柱层析纯化。

表1 化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ在不同浓度下作用24、48、72 h对HeLa细胞的抑制率/%

注：与阴性对照组比较，*P<0.05。

表2 化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ在不同浓度下作用24、48、72 h对SiHa细胞的抑制率/%

注：与阴性对照组比较，*P<0.05。

本研究表明3种目标化合物对人子宫颈癌HeLa和SiHa细胞均具有较好的抑制活性。用化合物Ⅰ～Ⅲ依次对人子宫颈癌HeLa细胞进行处理时发现：质量浓度为100 μg/mL时，细胞抑制率依次为85.66%、79.23%和57.96%；当作用于人子宫颈癌SiHa细胞时，质量浓度为50 μg/mL时，细胞抑制率依次为94.17%、92.39%和85.81%；在3个化合物中化合物I展现更好抑制活性，在同一浓度，抑制率达到最高，原因可能是卤代原子的吸电子效应，增加了药物的抑制活性，而其中的F原子的电负性最强，吸电子能力也最大，致使化合物I表现出了相对其它2个化合物更强的抑制活性。随着作用的时间增长，3种目标化合物的抑制率也逐渐增加，在同一时间时，随着浓度增加，化合物的抑制率也明显增加。

综上所述，3种4-卤代-2′,4′-二甲氧基查尔酮对HeLa和SiHa细胞增殖均有较强的抑制活性，其中氟代查尔酮的活性最强，并具有浓度和时间依赖性特点。

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