松花粉对急性汞中毒大鼠肝肾的保护作用及机制研究

王 蕾，谢月群，张 和

0 引言

松花粉(PiniPollen)是松科(Pinaceae)植物马尾松(PinusmassonianaLamb.)、油松(PinustabuliformisCarr.)或同属数种植物的干燥花粉[1]，含有丰富的黄酮、微量元素硒、维生素C、维生素E卵磷脂、酶类和多种植物激素等生物活性物质或营养物质[2-3]。研究表明，松花粉具有治疗前列腺增生、促进锌的吸收、抗衰老、抗疲劳、保护心脑血管、降低血脂、提高性功能、保肝等作用[3]。多项小鼠、大鼠实验从改善学习记忆、保护肝细胞、保护肾脏、促血砷排泄、提高抗氧化能力、抑制大脑皮质细胞和肾脏细胞凋亡、促进造血等方面，研究松花粉对铅、砷中毒的保护作用[2,4-9]。

汞及其化合物能通过多种途径对机体产生以神经性、肝脏和肾脏毒性为主的多系统损害[10]。汞污染已成为一个全球性污染问题，随着汞及其化合物的污染问题日益严重，如何预防及治疗汞及其化合物对机体的毒性作用显得极其重要[11]。故研发安全、有效的汞中毒防治药物具有深远的意义。本文通过皮下注射HgCl2溶液建立大鼠急性汞中毒模型，研究松花粉对急性汞中毒的保护作用和机制，以期为松花粉预防和治疗急性汞中毒提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料 SPF级健康SD大鼠50只，雌雄各半，体重(200±20)g (温州医科大学实验动物中心)。松花粉(南京如来福生物工程有限公司)用0.5%CMC-Na制成0.2、0.4、0.8 g/mL的混悬液；HgCl2(上海试四赫维化工有限公司)用生理盐水制成1 mg/mL的溶液。尿素氮(BUN)、尿蛋白、尿乳酸脱氢酶(LDH)、尿碱性磷酸酶(ALP)测试盒(南京建成生物工程研究所)；丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、总胆红素(TBIL)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、谷胱甘肽(GSH)和丙二醛(MDA)测试盒(上海朗顿生物科技有限公司)。高速离心机(上海医用分析仪器厂)，高速组织匀浆机(艾卡广州仪器设备有限公司)，7700型电感耦合等离子体质谱仪(美国Agilent公司)，680型酶标仪(美国Bio-Rad公司)。

1.2 方法

1.2.1 分组、给药和样品采集 50只SPF级健康SD大鼠，随机分为正常对照组，染汞模型组，松花粉低、中、高剂量组(2、4、8 g/kg)，每组10只，雌雄各半。正常对照组大鼠按2.5 mL/kg剂量，皮下注射生理盐水；其他组大鼠按2.5 mL/kg剂量，皮下注射1 mg/mL HgCl2溶液，连续2 d，建立急性汞中毒模型[11]。末次染汞后，对照组和染汞模型组分别按10 mL/kg剂量，灌胃给予0.5% CMC-Na；松花粉低、中、高剂量组(2、4、8 g/kg)分别按10 mL/kg剂量，灌胃给予0.2、0.4、0.8 g/mL的松花粉混悬液；每天早晚各1次，持续5 d。末次给药后，将大鼠移入代谢笼中，收集12 h的尿液，用于测定尿汞、蛋白、LDH和ALP的含量或活性，在此期间停止食物供应，但给予自由取用去离子水。尿液收集12 h后，水合氯醛麻醉大鼠，将大鼠以仰卧位固定在手术操作台上，剪开腹部皮毛，然后腹主动脉取血，静置1 h，以3 000 r/min离心10 min，分离得到血清，用于测定血汞、BUN、ALT、AST和TBIL的含量或活性。将大鼠处死，解剖分离得到肾脏和肝脏，准确称取肾脏和肝脏各1.0 g，分别加入9 mL生理盐水，在冰浴上制成10%组织匀浆，以3 000 r/min离心10 min，获得上清液，用于测定肝汞和肾汞及肾脏和肝脏中SOD、GSH-Px、GSH和MDA的含量或活性。

1.2.2 测定指标及方法 肝汞、肾汞、血汞和尿汞的含量通过7700型电感耦合等离子体质谱仪进行测定[12]。BUN、尿蛋白、尿LDH、尿ALP、血清ALT、血清AST和血清TBIL及肾脏和肝脏中SOD、GSH-Px、GSH和MDA的含量或活性均通过相应试剂盒进行测定。

2 结果

2.1 松花粉对急性汞中毒大鼠肝汞、肾汞、血汞和尿汞含量的影响 由表1可知，与正常对照组比较，染汞模型组大鼠肝汞、肾汞、血汞和尿汞含量均增加(P<0.01)，表明急性汞中毒模型造模成功。与染汞模型组比较，松花粉组大鼠肝汞、肾汞和血汞含量均降低(P<0.01)，松花粉低、中、高剂量组大鼠尿汞含量增加(P<0.05或P<0.01)，表明松花粉具有清除体内汞蓄积的作用。

2.2 松花粉对急性汞中毒大鼠BUN、尿蛋白、尿LDH和尿ALP含量或活性的影响 由表2可知，与正常对照组比较，染汞模型组大鼠BUN、尿蛋白、尿LDH和尿ALP含量或活性均增加(P<0.01)，表明急性汞中毒导致了大鼠急性肾损伤。与染汞模型组比较，松花粉低、中、高剂量组大鼠BUN、尿蛋白、尿LDH和尿ALP含量或活性均降低(P<0.05或P<0.01)，表明松花粉对急性汞中毒诱导的急性肾损伤具有一定的修复作用。

表1 各组大鼠肝汞、肾汞、血汞、尿汞含量比较

注：与正常对照组比较，**P<0.01；与染汞模型组比较，#P<0.05，##P<0.01

表2 各组大鼠BUN、尿蛋白、尿LDH、尿ALP含量或活性比较

注：与正常对照组比较，**P<0.01；与染汞模型组比较，#P<0.05，##P<0.01

2.3 松花粉对急性汞中毒大鼠血清ALT、AST、TBIL活性的影响 由表3可知，与正常对照组比较，染汞模型组大鼠血清ALT、AST和TBIL活性均显著增加(P<0.01)，表明急性汞中毒引起了大鼠急性肝损伤。与染汞模型组比较，松花粉低、中、高剂量组大鼠血清ALT、AST和TBIL活性均显著降低(P<0.05或P<0.01)，表明松花粉对急性汞中毒诱导的急性肝损伤具有一定的修复作用。

表3 各组大鼠血清ALT、AST、TBIL活性比较

注：与正常对照组比较，**P<0.01；与染汞模型组比较，#P<0.05，##P<0.01

2.4 松花粉对急性汞中毒大鼠肾脏和肝脏中SOD、GSH-Px、GSH和MDA活性或含量的影响 由表4、表5可知，与正常对照组比较，染汞模型组大鼠肾脏和肝脏SOD、GSH-Px和GSH活性或含量均降低(P<0.01)，染汞模型组大鼠肾脏和肝脏MDA含量增加(P<0.01)，表明急性汞中毒引起了大鼠肝脏和肾脏的脂质过氧化损伤。与染汞模型组比较，松花粉低、中、高剂量组大鼠肾脏和肝脏SOD、GSH-Px和GSH活性或含量均增加(P<0.05或P<0.01)，松花粉低、中、高剂量组大鼠肾脏和肝脏中的MDA含量降低(P<0.05或P<0.01)，表明松花粉对急性汞中毒引起的肾脏和肝脏的脂质过氧化损伤具有一定的修复作用。

3 讨论

HgCl2诱导的急性汞中毒大鼠模型被广泛用于研发汞中毒防治药物，HgCl2经皮下注射后迅速分布于各组织，其主要分布于肾脏和肝脏[11,13]。BUN、尿蛋白、尿LDH和尿ALP含量或活性是体现肾功能正常与否的重要指标，急性汞中毒可诱导急性肾损伤，进而导致BUN、尿蛋白、尿LDH和尿ALP含量或活性升高[11,13]。血清ALT、AST和TBIL活性是体现肝功能正常与否的重要指标，急性汞中毒可诱导急性肝损伤，进而导致血清ALT、AST和TBIL活性升高[14]。急性汞中毒可诱导脂质过氧化，进而损害肝脏和肾脏的正常功能[15]。MDA是脂质过氧化的重要产物，MDA可能引起细胞代谢及功能障碍，甚至死亡，其含量与细胞损伤的程度呈正相关，因此，测定MDA含量可反映机体内脂质过氧化的程度，间接反映细胞损伤的程度[16]。SOD、GSH-Px、GSH能够抑制脂质过氧化的发生，进而防止脂质过氧化对组织的损害[17]。

表4 各组大鼠肾脏SOD、GSH-Px、GSH、MDA活性或含量比较

注：与正常对照组比较，**P<0.01；与染汞模型组比较，#P<0.05，##P<0.01

表5 各组大鼠肝脏SOD、GSH-Px、GSH、MDA活性或含量比较

注：与正常对照组比较，**P<0.01；与染汞模型组比较，#P<0.05，##P<0.01

研究发现，大鼠皮下注射HgCl2后，与正常对照组比较，其肝汞、肾汞、血汞、尿汞、BUN、尿蛋白、尿LDH、尿ALP、血清ALT、血清AST、血清TBIL、肾脏MDA和肝脏MDA含量或活性均显著升高，肾脏和肝脏SOD、GSH-Px、GSH含量或活性均显著降低。结果表明，HgCl2诱导的急性汞中毒大鼠模型造模成功，并且急性汞中毒可引起大鼠肾脏和肝脏的损伤，其机制可能与HgCl2诱导的脂质过氧化损伤相关。研究发现，灌胃给予急性汞中毒大鼠松花粉后，其尿汞含量进一步增加，上述其余指标均向正常对照组的数值变化。结果表明，松花粉具有清除体内汞蓄积、修复急性汞中毒诱导的急性肝肾损伤的作用，其机制与抑制脂质过氧化损伤相关。本研究较全面地研究了松花粉通过抑制脂质过氧化损伤对急性汞中毒肝肾的保护作用，但对于分子生物机制并无阐述，进一步的研究应该从松花粉的具体分离成分入手，研究其药效，并分析其作用信号通路。

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