烟曲霉生物膜研究进展

童建波 曾荣 李岷

(中国医学科学院 北京协和医学院皮肤病研究所 江苏省皮肤性病学分子生物学重点实验室，南京 210042)

由于广谱抗菌药物、糖皮质激素和免疫抑制剂的广泛使用、放疗和化疗、器官移植以及侵入性治疗措施的急剧增加、艾滋病等免疫缺陷性疾病的流行，侵袭性曲霉病的发病率在近年来快速上升[1]。尽管不少新型抗真菌药物如两性霉素B、伏立康唑、米卡芬净等在体外对烟曲霉均显示有较好的药物敏感性，但临床上疗效却往往不如体外试验那么理想。据统计该病的致死率可高达50%～95%[2]。在侵袭性肺曲霉病患者的支气管肺泡灌洗液检查和侵袭性曲霉病的患者尸体检查中发现了存在一种特殊的膜样形态结构,后证实这种膜样结构正是烟曲霉的生物膜形态[3],而该形态在体内的出现也正是烟曲霉在体内耐药的重要原因之一。因此，近年来烟曲霉生物膜逐渐成为研究者关注的热点。

1 烟曲霉生物膜的形成特点

目前研究生物膜的形成和结构特点主要通过以下3种方式获得生物膜模型：体外、体内构建生物膜模型及采集临床自然形成的生物膜模型。典型的真菌生物膜形成阶段主要包括：①真菌孢子黏附于载体接触面；②微菌落的形成；③真菌细胞分泌细胞外基质，微菌落融合形成生物膜；④发育为成熟的生物膜；⑤真菌细胞和生物膜碎片播散形成新的生物膜[4]。

研究发现烟曲霉生物膜形态好发于遗传性肺功能异常的患者如肺囊性纤维化或慢性阻塞性肺疾病以及有外来器械植入物的患者如导管、假体、心脏起搏器、关节置换装置、心脏瓣膜和乳房植入物等[5-6]。烟曲霉最初以孢子形式黏附在生物或非生物表面，菌丝体随生物膜的成熟而生长，随后由其自身产生的细胞外基质 (ECM)将生物膜融合成一体，形成均匀致密的三维立体结构。Mowat E等[7]率先运用96孔细胞培养板体外成功构建烟曲霉生物膜模型，并使用激光共聚焦显微镜 (CLSM)动态观察生物膜的形成过程。随后学者陆续尝试使用兔、大鼠、猴、绵羊、小鸡等多种动物用来构建侵袭性曲霉病的模型以开展阐明其发病机制、评价药物疗效、免疫预防以及寻找曲霉致病因子等多种研究[8-10]。

2 影响烟曲霉生物膜形成的因素

烟曲霉生物膜的形成受多种因素调控。附着材料不同将会影响生物膜的形成，如体外构建生物膜模型时常采用橡胶导管、圆柱状的纤维过滤器，不同材料制成的细管、玻片、塑料等，在不同基质材料上形成的真菌生物膜量有所不同[11]。培养液的成分差异也会影响生物膜的形成，如血清可以促使烟曲霉菌丝的生长和生物膜的形成，在加有胎牛血清或胎球蛋白A的培养液中形成的烟曲霉生物膜厚度明显增加，对多种抗真菌药物耐药性也明显增强[12]。生物膜形成过程中群体感应现象普遍存在，是指微生物自身群体密度的环境信号感受。生物膜是在信号分子精密监控下的有组织的细胞群落。烟曲霉生物膜在形成过程中，细胞外的可扩散自身感应成分检测并调节细胞总体密度，以利于生物膜的形成[13]。Exodenous DNA (eDNA)是成熟的烟曲霉生物膜细胞外基质中的一种重要成分，对生物膜的形成及维持结构的完整性和稳定性起着重要的作用[14]。

3 烟曲霉生物膜的致病性

黏附是烟曲霉孢子致病性的第1步。胞外多糖GAG是烟曲霉生物膜黏附过程中关键的毒力因子，在介导生物膜形成的启动黏附中发挥着重要的作用[15]。疏水蛋白RodB、RodD、RodE、RodF作为烟曲霉细胞外基质成分介导菌细胞相互黏附及对宿主的黏附，在烟曲霉生物膜形成过程中调控RodA、RodB、RodD蛋白相关基因的转录水平明显上调[16]。烟曲霉菌生物膜形成过程中，其营养代谢活性降低、氧化应激反应增强、胶霉毒素产生增加从而能够很好逃避机体的免疫反应[17]。研究发现，与悬浮状态细胞相比，从生物膜中脱落的细胞致病力显著增强[18]。

4 烟曲霉生物膜的耐药机制

生物膜的一个显著特性就是对各种抗真菌药物的高度耐药性。真菌生物膜对药物的抵抗性是游离真菌的1 000倍[19]。真菌生物膜的耐药机制由复杂的、多种机制共同参与，包括一些基本的物理性屏障作用和一些复杂的调控过程。

4.1 生物膜的屏障作用

生物膜的复杂结构和细胞外基质可能通过阻碍药物扩散而增加药物抵抗性，研究发现曲霉菌生物膜外基质的产生可降低药物的抗菌作用。β-1，3葡聚糖在烟曲霉生物膜形成的早期起到药物海绵的作用，而在生物膜的成熟期eDNA不仅促进生物膜的成熟并保持生物膜结构的完整性，而且在药物抵抗上可能起到更重要的作用[20]。

4.2 耐药基因的表达

ABC转运蛋白超家族和主要易化子超家族MFS是真菌主要转运蛋白超家族，ABC转运蛋白超家族是1种ATP结合型转运蛋白是主要外排蛋白，包括5个蛋白家族：其中多药耐药家族MDR、多药耐药相关蛋白家族MRP和多效性耐药家族PDRI 3个蛋白家族与胞内毒性物质的外排密切相关；MFS转运蛋白中也有两个家族与外排毒性物质功能相关。ABC和MFS的高表达可引起多种抗真菌药尤其是三唑类抗真菌药物交叉耐药[21]。在烟曲霉生物膜中MDR1表达明显上调[22]。相比于悬浮状态，MFS在烟曲霉生物膜中也发现表达增强[23]。曲霉菌生物膜对伊曲康唑和伏立康唑的抵抗与流出泵基因AfuMDR4密切相关。麦角固醇生物合成基因Ergl是诱导特比萘芬耐受的作用靶点[24],在烟曲霉菌生物膜形成过程中，Erg基因表达增加，生物膜对特比萘芬的抵抗性增强[25]。

4.3 毒素蛋白的合成

在慢性曲霉菌感染中，产生的胶霉毒素等一些代谢产物有利于真菌逃避宿主的免疫反应，生物膜中黑色素的产生也可影响曲霉菌的侵袭力及机体对曲霉菌的免疫反应[26]。

4.4 生物膜中细胞的生长状态

细胞的生长速度通常是药物活性调节的一个重要因素，细胞生长速度越快，药物的活性调节能力越强[27]。由于营养获得的限制，生物膜中的细胞生长缓慢或呈现饥饿状态，真菌的代谢速率降低表现出真菌细胞对抗真菌药物的不敏感。

5 观察烟曲霉生物膜常用的形态学的常用方法

对真菌生物膜形成和结构的观察主要借助于各种显微技术的应用，如扫描电镜、荧光电镜、激光扫描共聚焦显微镜等。

5.1 扫描电镜

扫描电镜是目前最直观、常用观察生物膜的方法之一，无须切片就可直接观察生物膜中菌丝、多糖的分布情况。 Alejandra等[6]通过扫描电镜分别观察28℃和37℃体外烟曲霉生物膜的动态生长周期，烟曲霉生物膜4 h开始孢子黏附于并分泌聚合物质。8～12 h时孢子萌芽，产生菌丝并延长，有趣的是在28℃时更多的是形成微菌落。16～20 h菌丝开始形成立体网状结构，并可以观察到通道形成，这也就为生物膜提供了一个营养物质代谢的通道。24 h就可以形成一个具有复杂的三维立体结构特征的成熟的生物膜结构，菌丝有序排列，大量细胞外基质分布在菌丝的周围，只有在成熟期的生物膜才开始出现孢子的扩散。 特别值得提出的是Alejandra等[28]认为烟曲霉生物膜的最佳孢子浓度为1×106CFU/mL，这和之前的文献报道观点不同[8]，可能的原因是在体外构建生物膜时与所选用的材料不同有关。CourCtney等[29]运用电镜观察烟曲霉生物膜结构的同时,发现随着生物膜的成熟，ECM逐渐在菌丝间延伸积累并紧密包裹住生物膜。

5.2 激光扫描共聚焦显微镜

激光扫描共聚焦显微镜应用于观察生物膜形态具有其独特的优势，不仅能对荧光标记的细胞或组织的某一层面分别获取其各色荧光的清晰图像，对于一定厚度的生物膜能各层面逐层扫描摄影，经软件处理，可以得到生物膜的色彩立体图像及计算机动画演示。对生物膜的厚度、比表面积、均一性及各种荧光的强度等多个参数进行量化比较，即可方便的获取到真菌形成生物膜动态过程的各种量化数据[30]。Villena等[31]使用免疫荧光标记技术，用荧光染料FITC-FUN1标记多糖，用CLSM连续逐层扫描图像行三维重建，动态观察发现烟曲霉生物膜形成中菌丝呈现严密的极性生长。我们在前期的研究中也发现在低热作用下可以破坏烟曲霉生物膜的极性生长。成熟的生物膜是细胞外基质包裹下的由孢子、菌丝体组成的均一致密的三维网状结构。完整成熟的烟曲霉生物膜结构厚度通常可以到达200 μm左右[32]。

上述两种技术在生物膜的检测中应用甚广，扫描电镜的优点是能直接观测生物膜中细胞的情况，但需要对标本进行脱水、固定、包埋、染色等处理，这样就破坏了生物膜的完整性，可能会导致观察结果与实际有差异，而激光共聚焦显微镜恰好可以弥补这一不足。但两者都只能通过直观视觉来判断，没有很好的量化标准。

6 测定烟曲霉生物膜常用的生物膜量及活力的常用方法

6.1 结晶紫分光光度法 (CV法)

CV法是对真菌生物膜培养后，进行结晶紫染色后冲洗、脱色后用紫外分光光度计检测脱色液在某一波长光波的吸收值，计算染色菌体数量对真菌生物膜形成进行粗略定量分析的方法。Vinícius等[33]在96孔板中接种烟曲霉菌悬液37℃培养24 h后运用结晶紫染色后在570 nm波长测定烟曲霉生物膜形成量，对比观察ΔsitA对生物膜形成的影响的。其缺点是不能做到很好地区分生物膜中活菌和死菌及细胞外基质，不能准确地反映生物膜的活力，但仍然可以较好地显示动态对比中生物膜总生成量的变化。

6.2 MTT即四氮唑盐减低法

MTT在活细胞线粒体中琥珀酸脱氢酶作用下代谢还原，不溶于水的蓝色或蓝紫色甲臜在细胞色素C的作用下生成并沉积在细胞中，通过二基亚砜 (DMSO)溶解细胞中的甲瓒，就可以在酶标仪490 nm处测定甲臜的含量。活细胞数与甲臜产生量呈正相关，因此活细胞的数目可根据吸光值推测出。MTT法以其快速简便，不需要特殊检测仪器，无放射性同位素，适合大批量检测的特点而得到广泛应用。

6.3 XTT减低法

是目前研究生物膜最为常用的方法,XTT 即甲基四氮盐是一种类似于MTT的化合物，在电子耦合试剂存在的情况下，活细胞线粒体中存在与辅酶Ⅱ相关的脱氢酶，可将黄色的XTT还原成水溶性的橘黄色的四氮盐-甲臜产物，该代谢产物能溶解在组织培养基中，在490 nm处的吸光值与细胞的活力成正比。该法在不破坏生物膜的条件下能检测出生物膜中菌细胞的活力。优点在于XTT及其产物有良好的水溶性，给实验操作带来极大的方便，而且可以不破坏生物膜的完整结构来研究生物膜中菌细胞的活性，另外它还具有使用方便、不用洗涤细胞、检测快速的特点，因此，XTT法在研究真菌细胞生物膜的生长动力学和耐药性方面得到了极为广泛的应用[34]。

多种荧光染料方法可用于生物膜的量及活力测定。绿色荧光核酸染料Syto9和刃天青显色法适用于生物膜活力测定，二甲基亚甲基蓝DMMB比色法和荧光素FDA法也较好的应用于检测生物膜形成的总量[35]。

7 结 语

目前对烟曲霉生物膜的基本结构和特性有了初步的了解，但仍然存在很多问题有待解决，如它的信号群感系统的建立、确切的耐药机制及现在发现的真菌/细菌混合性生物膜的特性等，进一步了解烟曲霉的生物膜形成机制和耐药机制、明确生物膜在致病和耐药方面的遗传学机制；对其进一步的研究有助于指导临床治疗、降低死亡率、改善预后。

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