慢性炎症性声带疾病核转录因子kappa B信号通路的表达变化*

曾新宇，曲亚明，利显民，王富森

（广东省深圳市宝安区人民医院 耳鼻咽喉科，广东 深圳 518101）

随着社会因素和生物因素的不断变化，急慢性咽喉炎、声带息肉和声带小结等炎症性声带疾病的发病率逐年升高，严重影响患者的生活质量，成为耳鼻喉科的常见疾病[1]。根据文献报道[2]，在心肌缺血再灌注损伤导致的炎症、脓毒症诱导的急性肝损伤中，toll样受体4（toll-like receptor4，TLR4）/核转录因子kappa B（nuclear transcription factor kappa B，NF-κB）信号通路在炎症反应的调控方面发挥重要作用。TLR4可导致NF-κB激活并入核，从而启动白细胞介素6（interleukin 6，IL-6）、肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor alpha，TNF-α）等炎症因子基因的表达[3-5]。然而炎症性声带疾病患者的TLR4/NF-κB信号通路是否发挥作用尚未见报道。本文旨在阐明炎症性声带疾病患者病理组织中TLR4/NF-κB信号通路的表达变化，为炎症性声带疾病的防治提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 研究对象

选取2015年6月-2017年1月在深圳市宝安区人民医院耳鼻咽喉头颈外科就诊断的炎症性声带疾病（经HE染色证实）手术患者的声带病变组织（疾病组）和正常声带组织（对照组）（喉癌手术中切取）各50例。符合本院伦理委员的标准并得到委员会的批准，所有入选者都已签订知情同意书。排除标准：疾病组和对照组中均排除孕妇、合并其他感染性疾病、外伤、肿瘤及严重肝肾功能不全等患者。疾病组男29例，女21例；年龄33～56岁，平均（42.6岁）。对照组男26例，女24例；年龄30～52岁，平均（40.5岁）。两组患者一般资料比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

1.2 研究方法

1.2.1 手术患者声带病变组织HE染色 将手术切除的声带病变组织取出后，用生理盐水冲洗，洗净后将组织块放入液氮中，进行冷冻切片，并进行苏木素-伊红染色（HE染色），显微镜下观察声带病变组织的病理学变化。

1.2.2 ELISA检测TNF-α、IL-6、白细胞介素1β（IL-1β）的含量 按照ELISA试剂盒说明书进行实验：①标准品的加样与稀释（倍比稀释法）；②加样：分别设空白孔（空白孔不加样品及酶标试剂，其余各步骤操作相同）和待测样品孔；③37℃温育30 min；④配洗液、洗涤5次，1 min/次；⑤加酶标试剂；⑥温育、洗涤5次，1 min/次；⑦加试剂显色；⑧加终止液终止；⑨测定：以空白孔调零，用酶标仪在相应波长下测定光密度（OD）值，通过标准曲线计算样品中TNF-α、IL-6、IL-1β的含量。

1.2.3 实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测TLR4 mRNAA 的表达 在Pubmed数据库中查询TLR4并获取其编码序列，采用Premer Premier 5.0软件设计引物，引物序列见附表。采用离心柱型总RNA提取试剂盒，按说明书提取总RNA；按逆转录试剂盒说明书配制反应体系，将RNA逆转录为cDNA，逆转录的反应条件为：42℃ 60 min，70℃ 5 min；以cDNA为模板进行实时荧光定量聚合酶链反应（quantitattiivvee real-time polymerase chain reaction，qRT-PCRR） 检测，反应体系为 ：cDNA 2μl，正反向引物各 0.8μl，ddH2O 8.9μl， 荧 光 mix 12.5μl， 共 25μl。PCR 反应条件为 ：95℃ 10 min ；95℃ 15 s，59℃ 30 s，72℃30 s，40个循环。以GAPDH表达量为参照，进行相对定量分析。

1.2.4 Western blot检测TLR4蛋白的表达水平 采用全蛋白提取试剂盒提取疾病组和对照组组织全蛋白，取20μl全蛋白样品进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝胶电泳，半干转恒压转膜15 V 20 min，5%脱脂奶粉摇床上孵育封闭2 h，与anti-TLR4或anti- NF-κB p65或NF-κB p-p65 于4℃摇床上孵育过夜，HRP标记二抗常温摇床上孵育2 h，洗膜后于凝胶成像分析仪上成像分析，TLR4的表达量以β-actin表达量为参照进行计算，计算TLR4与β-actin条带灰度值的比值并进行分析。NF-κB p65的磷酸化水平以NF-κB p65和NF-κB p-p65的表达量进行计算。

附表 TLR4及GAPDH进行qRT-PCR引物序列

1.3 统计学方法

采用SPSS 17.0软件进行统计学分析，结果以均数±标准差（±s）表示。两组间比较采用两独立样本t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 手术患者声带病变组织病理改变

声带组织表面覆盖无角化鳞状上皮，间质水肿，见少量淋巴细胞浸润，符合声带炎症，见图1。

2.2 两组TNF-α、IL-6、IL-1β的含量比较

疾病组与对照组患者病理组织中TNF-α、IL-6和IL-1β含量比较，采用t检验，差异有统计学意义（t=5.250、7.569和11.040，均P=0.000），疾病组TNF-α、IL-6和IL-1β含量高于对照组。见图2。

图1 手术患者声带息肉病理切片 （HE染色）

2.3 两组TLR4 mRNA及蛋白的表达

疾病组TLR4 mRNA及蛋白的表达水平降低，与对照组比较，差异有统计学意义（t=6.484和4.533，P=0.000和 0.011），见图 3。

2.4 两组NF-κB p65磷酸化水平

疾病组与对照组病理组织中NF-κB p65磷酸化水平比较，采用t检验，差异有统计学意义（t=3.049，P=0.016），疾病组NF-κB p65磷酸化水平高于对照组，见图4。

图2 两组TNF-α、IL-6、IL-1β的含量比较

图3 两组TLR4 mRNA及蛋白的表达

图4 两组NF-κB p65磷酸化水平比较

3 讨论

Toll样受体（toll-like receptors，TLRs）是模式识别受体（pattern recognition receptor，PRR）家族的主要成员，是一种识别高度保守的病原相关分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMPs），能将细胞外抗原识别信息向细胞内传递并引发炎症反应，构成抗感染的第一道防线[6]。TLRs家族有超过13个亚型，其中TLR4是最早被发现的，它是识别多种PAMPs的关键亚型，尤其是革兰阴性细菌脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）[7]。最近的研究发现[8]，TLR4也可结合损伤组织和坏死细胞释放的内源性分子。因此，无论在感染性和非感性刺激导致的炎症反应中，TLR4都是一个非常关键的受体。GUEDIA等[9]研究表明，在LPS介导的胃肠运动障碍中，HIV和TLR4相互作用促进炎症反应的发生并促进免疫反应激活；YANG等[10]研究表明，TLR4在心肌梗死、缺血再灌注损伤和心力衰竭等非感染性疾病中发挥重要作用。随着社会的进步与发展，现代人的压力越来越大，不良的生活习惯、过度用嗓、空气污染及多种新病原体出现等感染或非感染性因素都可成为炎症性声带疾病的病因，因此，TLR4可能在炎症性声带疾病的发生发展过程中发挥作用。本次研究结果显示：疾病组患者病理组织中TLR4 mRNA及蛋白的表达水平高于对照组，提示TLR4在炎症性声带疾病中发挥作用。

NF-κB被认为是控制炎症反应的核心因子[11]，其家族主要由5个亚单位组成：p50、p52、p65、RelA/B和c-Rel，其中p65为NF-κB发挥功能所必需[12]。TLR4经过一系列构象变化及细胞内传递作用激活一个非常重要的转录因子，即NF-κB，使NF-κB p65亚单位上的S536磷酸化，结合到靶向的DNA，通过调控多种基因表达进而促进多种炎症介质和细胞因子的表达，发挥防御和免疫调节作用[13-14]。本研究结果显示：疾病组患者病理组织中NF-κB p65磷酸化水平高于对照组，提示NF-κB的激活是炎症性声带疾病炎症反应的机制之一。TLR4/NF-κB信号通路的炎症因子主要有TNF-α、IL-6、IL-1β[14]等，本研究结果显示：疾病组患者病理组织中TNF-α、IL-6、IL-1β的含量高于对照组，说明炎症性声带疾病患者病理组织中TLR4/NF-κB信号通路发生活化。

综上所述，TLR4/NF-κB信号通路可能在炎症性声带疾病中发挥作用，本研究为炎症性声带疾病的治疗提供了干预靶点。

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