miR-1和miR-369在中外猪种背最长肌中的表达与肉质性状的关系研究

杨雪梅，顾以韧，梁 艳，陶 璇，杨跃奎，曾 凯，陈晓晖，钟志君，吕学斌

（四川省畜牧科学研究院，动物遗传育种四川省重点实验室，四川 成都 610066）

miRNA是一类内生的、长度约为20～22个核苷酸，通过结合到靶mRNA上参与基因转录后水平调控的非编码小分子RNA，其在基因表达调控、脂肪细胞分化、脂质代谢等生理过程中均发挥着重要的作用[1-3]。先前研究显示miR-1可通过HDAC4作为靶基因促进肌发生，对调节骨骼肌增殖与分化起了非常重要的作用[4]，它会与转录因子结合，促进心肌细胞膨胀，从而抑制心肌细胞的增殖；miR-369通过招募AGO2和FXR1蛋白复合体结合到肿瘤坏死抑制因子-α基因3′UTR区域的腺嘌呤/尿嘧啶富集元件上靶向调控TNF-α的表达[5]，TNF-α与猪肉品质存在显著相关。

鉴于这两种miRNA与猪肉品质调控存在的关系，研究采用Q-PCR技术对四川省4个地方猪种和约克夏背最长肌组织中miR-1和miR-369的表达与肉质性状的差异进行了研究。该研究将为进一步探明不同猪种肉质差异形成的分子机制提供基础数据，并为培育优质高效的新品种/配套系提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物及样本采集

该试验于2015年12月在四川省畜牧科学研究院种猪科研基地进行。每个猪种随机选取6头，共计30头，所有试验猪只于同一时间开始组建群体，30日龄断奶，采用相同营养水平和饲喂方式，达到9月龄时进行屠宰，屠宰前停食24 h，自由饮水。屠宰后迅速采集倒数3～4肋骨间对应处的背最长肌组织，用于后续的肉质相关表型指标测定和miRNA荧光定量检测。

1.2 肌内脂肪含量（IMF）测定

采用瑞士步琪（BUCHI）全自动快速抽提仪进行抽提，程序设置为萃取2 h，淋洗5 min，干燥20 min，每个样本独立测定两次。样品处理和试验操作严格按照国标GB/T 9695.1—2008《肉与肉制品游离脂肪含量测定》进行。

1.3 肌纤维直径测定

采用KD-2508型切片机（Kedee,China）制作背最长肌样本的冰冻切片，H.E染色后用显微成像系统（Optec,China）采集代表性区域图像，通过Motic Images Advanced 3.2显微图像分析软件测定每个样品的肌纤维面积。

1.4 硫胺素含量测定

样本处理和试验方法参照国家标准GB/T 5009.84—2003《食品中硫胺素（维生素 B1）的测定》。

1.5 眼肌面积和瘦肉率测定

测量左胴体倒数3～4肋眼肌的宽、高，按照宽×高×0.7计算眼肌面积。按猪胴体性状测定技术规范（NY/T 825—2004）方法测定并计算瘦肉率。

1.6 miR-1和miR-369含量的测定

引物信息见表1。所有目的miRNA定量结果均通过溶解曲线分析验证PCR产物的特异性，确保产物无引物二聚体，每个样本重复3次，每次检测含3个阴性对照。采用2-ΔΔCt法计算目的miRNA的相对表达量。

表1 引物信息

1.7 统计方法

试验数据采用Sigmaplot 12.0对性状指标和基因表达量进行ANOVA分析，相关性采用Pearson Correlation程序分析。

2 结果与分析

2.1 相关肉质指标含量

由表2可知，在5个猪种中，藏猪肌内脂肪含量最高（5.62%），其次为雅南猪（5.09%），约克夏猪最低（2.06%），地方猪种极显著高于外种猪（P＜0.01）。在4个地方猪种中，藏猪、雅南猪和内江猪的肌内脂肪含量极显著高于成华猪（P＜0.01）；藏猪肌纤维直径最小（68.12 μm），显著小于其它3个地方猪种（P＜0.05），约克夏肌纤维直径最大（92.74 μm），极显著大于 4个地方猪种（P＜0.01）；4个地方猪种的眼肌面积在14～22 cm2之间，藏猪和成华猪的眼肌面积显著低于雅南猪、内江猪（P＜0.05），约克夏猪的眼肌面积极显著高于4个地方猪种（P＜0.01）；藏猪的瘦肉率最低（42.74%），约克夏猪的瘦肉率最高（63.54%），4个地方猪种瘦肉率之间差异不显著，约克夏猪极显著高于4个地方猪种（P＜0.01）；雅南猪的硫胺素含量最高，为 2.84 μg/g，其次是藏猪（2.18 μg/g），内江猪硫胺素含量最低，为1.06 μg/g，其次为约克夏猪（1.21 μg/g），显著低于其它3个猪种（P＜0.05），藏猪、成华猪和雅南猪无显著差异。

表2 不同猪种相关肉质指标含量（n=6）

2.2 2种相关miRNA的表达水平

采用Q-PCR的方法，检测了miR-369和miR-1在猪背最长肌中的相对表达量，其结果见表3。由表3可知，成华猪的miR-369的相对表达量最高，其次为雅南猪，最低的为内江猪，内江猪的miR-369的相对表达量极显著低于其它4个猪种（P＜0.01），约克夏猪的miR-369的相对表达量显著低于藏猪、成华猪和雅南猪（P＜0.05）；藏猪miR-1的相对表达量最高，其次为成华猪，最低的为内江猪和约克夏猪，藏猪、成华猪和雅南猪的miR-1相对表达量极显著高于内江猪和约克夏猪（P＜0.01）。

表3 不同猪种的miR-369、miR-1水平（n=6）

2.3 2种miRNA的表达水平与肉质相关指标含量的相关性

采用Sigmaplot 12.0分析了肉质性状相关指标和基因表达量的相关性，由表4可知，miR-369、miR-1在背最长肌中的表达水平与肌内脂肪含量和硫胺素含量呈正相关（r肌内脂肪含量=0.5～0.7；r硫胺素=0.6~0.9），其中miR-369与硫胺素呈显著正相关（r=0.85，P<0.05）；miR-369、miR-1 在背最长肌中的表达水平与肌纤维直径、眼肌面积、瘦肉率呈负相关（r肌纤维直径=-0.1～-0.6；r眼肌面积=-0.3～-0.9；r瘦肉率=-0.3～-0.8），其中miR-1与眼肌面积呈显著负相关（r=-0.89，P<0.05）。

表4 miR-369、miR-1与肉质相关指标的相关性分析（n=6）

3 讨论

提供满足消费者需求的猪肉产品具有重要意义，近年来育种学家已在猪肉质的调控机理方面做了大量研究[6-8]，然而这些研究主要集中在DNA和mRNA水平的编码基因，随着miRNA的发现和功能研究的深入，从转录后的miRNA水平探索猪肉质差异形成的分子机理成为了研究的热点。影响猪肉质风味的因素很多，其中肌内脂肪含量是重要决定因素之一，其与肉的多汁性、嫩度和风味密切相关[9]，肌肉中的脂肪越多，则肉的多汁性越好，在5个猪种中，4个地方猪种的肌内脂肪含量在3.72%～5.62%之间，肉质优良，约克夏猪的肌内脂肪含量2.06%，极显著低于地方猪种；肌纤维直径越细，肉质就越细嫩，味美。研究显示4个地方猪种的肌纤维直径在60～80 μm之间，肉质细嫩，约克夏猪肌纤维直径为92.74 μm，极显著高于4个地方猪种；胴体瘦肉率是评价胴体品质的主要指标，与眼肌面积呈极显著正相关，与肌内脂肪含量呈负相关，4个地方猪种的胴体瘦肉率在42%～50%之间，属脂肪型猪种，约克夏猪达63.54%，极显著高于地方猪种；硫胺素是一种非常重要的风味前体物质，其热降解是食品加工过程中风味形成的主要途径之一[10]，研究显示藏猪、成华猪、雅南猪肌肉中的硫胺素含量较高，风味更好。由本研究可知，地方猪种均属于肉质优良猪种，其风味佳、口感好，但瘦肉率较低，可作为优质风味猪培育的育种素材。

miRNA对猪肌肉发育有着重要的调节作用[4]，Chen等[11]2006年研究发现miR-1在骨骼肌细胞分化成熟过程中呈现一定的时空特异性表达，促进骨骼肌细胞分化。miR-369靶向调控TNF-α的表达，在脂肪沉积过程中扮演着重要角色[5]。本研究采用荧光定量PCR技术对藏猪、成华猪、雅南猪、内江猪和约克夏猪背最长肌组织中miR-1和miR-369差异表达进行了研究。结果显示背最长肌组织中2个miRNA的表达水平在5个猪种中趋于一致。相关性分析显示，2种miRNA在背最长肌中的表达水平与肌内脂肪含量和硫胺素含量呈正相关，与肌纤维直径、眼肌面积和瘦肉率呈负相关，表明miR-1和miR-369对猪肉质具有正调控作用，而对猪胴体性能具有负调控作用，其可以影响猪肌肉生长和脂肪沉积，为通过调控其表达水平实现对猪肉质风味的改善提供了可能。

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