皮肤真菌微生态研究进展

王若珺 李若瑜

(北京大学第一医院皮肤性病科 北京大学真菌和真菌病研究中心 皮肤病分子诊断北京市重点实验室，北京 100034)

皮肤是人体与外界环境的重要屏障，寄居着丰富的微生物群落，包括细菌、真菌、病毒等，通常不具有致病性，起到抵御外界病原微生物侵入、防止水分丢失等作用。在湿润、干燥、脂溢性等不同环境的皮肤部位，微生物的群落构成具有很大差异[1]。随着对真菌内基因组转录间隔区 (internal transcribed spacer, ITS)高通量测序研究的深入，真菌微生态与皮肤疾病之间的关系逐渐引起人们重视。目前已证实，在银屑病、特应性皮炎、脂溢性皮炎等皮肤疾病中，皮肤真菌微生态会出现变化。本文将就皮肤正常真菌微生态构成、微生态研究方法学以及真菌微生态与皮肤疾病间关系3方面分别进行综述。

1 皮肤正常真菌微生态

皮肤表面的正常细菌和真菌菌群相对稳定[1]。按照生理学特征可将皮肤分为四类：湿润 (肘窝、腘窝、腹股沟、手指缝、足趾缝和鼻孔)、干燥 (前臂、小鱼际、臀部)、脂溢 (鼻唇沟、面颊、眉心、外耳道、耳后皱襞、枕后、胸骨柄和后背)和足趾甲[2]。既往对皮肤细菌微生态的研究显示，正常的细菌群落主要由厚壁菌门 (Firmicutes)、变形菌门 (Proteobacteria)、拟杆菌门 (Bacteroidetes)和放线菌门 (Actinobacteria)构成[2]。细菌微生态的复杂性和稳定性在不同皮肤部位差别很大，而不同个体相似的生理环境中微生态群落构成相似。例如，外耳道和耳后等脂溢性环境主要为葡萄球菌和丙酸杆菌，而腋下、腹股沟等湿润环境则主要为棒状杆菌[2]。

真菌培养已经证实，人类正常皮肤中存在马拉色菌属、念珠菌属等多种真菌。马拉色菌属 (Malasseziaspp.)是人体皮肤最常见的正常寄生菌，具有亲脂性，生长需要皮脂腺分泌的脂质化合物，在前额、前臂、腹股沟、耳后、肘窝等部位含量最丰富[3]。马拉色菌包括糠秕马拉色菌 (M.furfur)、合轴马拉色菌 (M.sympodialis)、球形马拉色菌 (M.globosa)、限制马拉色菌 (M.restricta)、厚皮马拉色菌 (M.furfur)等14个菌种，其中11种参与人体皮肤微生态构成[4]。马拉色菌属不同分离株的生长速度不同，糠秕马拉色菌和球形马拉色菌生长速度快，实验室分离率高，曾被认为是皮肤中含量最丰富菌种。既往的定量培养方法显示，后背皮肤糠秕马拉色菌含量较高，头皮和前额皮肤球形马拉色菌含量较高[5]。然而，近年的分子学研究则发现，皮肤中的含量最丰富的为球形马拉色菌和限制马拉色菌，含量远高于糠秕马拉色菌[6-8]。进一步微生态分析证实，手臂、足部、躯干和头面部等不同部位的皮肤中，马拉色菌属的结构有明显区别，但不同个体的相同身体部位差别不大[4]。在外耳道、耳后和前额皮肤中，限制马拉色菌含量最丰富，后背、枕后部和腹股沟区球形马拉色菌最丰富，鼻孔、肘窝等其他身体部位则为马拉色菌的混合菌种，而足部的真菌构成多样化，包括马拉色菌、曲霉 (Aspergillus)、隐球菌 (Cryptococcus)、红酵母 (Rhodotorula)和附球菌 (Epicoccum)等[4]。

2 皮肤真菌微生态的研究方法

与皮肤的细菌微生态相比，真菌微生态的研究难度更大，其原因主要有3方面因素：①真菌在皮肤中的含量远低于细菌，难以获得充分样本量。②人类细胞DNA会污染样本，干扰特异性区段的扩增。③真菌具有坚固的细胞壁，难以破坏细胞壁并提取出高质量遗传物质，其难度远高于细菌和人类细胞[9]。皮肤取材的方法包括拭子擦取和刀片刮取，有时需要使用擦拭-刮取-擦拭等组合方法。为获得最大微生物量，通常取材前12～24 h内不允许洗浴或使用润肤剂。取材后的样本应冻存于-20℃或-80℃条件。DNA提取需要使用较强的物理方式裂解真菌，常用滚珠和酶混合裂解方法。目前针对真菌微生态的DNA提取步骤尚缺少方法学上的对照研究[9]。

真菌菌种的分子鉴定基于高通量测序方法，目前常用的测序区段包括18S rRNA区和位于18S、5.8S和28S rRNA区内的ITS区[10]。以全基因组DNA为模板，应用聚合酶链式反应 (polumerase chain reaction, PCR)扩增上述区段，可得到数百万至数亿条序列，根据95%～99%相似度分类至种水平的分类操作单位 (operational taxonomic units, OTUs)，与Pubmed等数据库进行人工比对，即可通过DOTUR等软件分析样本微生物的结构[2]。微生物群落的丰度 (richness)和均衡度 (evenness)可以用香农多样性指数 (Shannon’s diversity index)表示，其他分析方法还包括：β多样性，用于样品两两之间的比较分析，衡量不同样本间的变化；排序分析，包括主成分分析 (principal component analysis, PCA)和主坐标分析 (principal coordinates analysis, PCoA)，用于研究样本间相似性和差异性；聚类分析，通过绘制热图 (heatmap)，提示样本间菌属菌落构成的相似性；物种进化树的样本群落分布图，可将不同样本的构成在物种进化分类树中显示，提示样本间的进化关系。此外，宏基因组测序能够反映样本中功能基因的构成[1-2]。

3 真菌微生态与皮肤疾病

既往对人体肠道、口腔等器官的微生态研究已证实，真菌微生态的改变与多种疾病的发生相关。例如，肠道内真菌菌落结构和细菌结构密切关联，真菌菌落的变化会引起肠壁中炎症反应增强，诱发炎症性肠病[11]；口腔黏膜真菌微生态发生变化与慢性黏膜念珠菌感染有关[12]。随着皮肤真菌微生态研究的深入，已证实皮肤真菌的菌落构成改变与多种炎症性、感染性皮肤疾病的发生相关。

特应性皮炎是由皮肤干燥及屏障功能受损所导致的慢性瘙痒性皮肤炎症性疾病。既往对细菌16s rRNA DNA区的测序分析结果显示，特应性皮炎患者皮肤中细菌群落结构发生紊乱，细菌微生态的整体多样性降低，葡萄球菌属相对增多，特别是金黄色葡萄球菌比例明显增加，并且与特应性皮炎严重程度正相关[13]。金黄色葡萄球菌可通过产生肽链形成生物膜形成定植，以及释放δ-毒素诱导肥大细胞脱颗粒诱发皮肤过敏反应[14-16]。对特应性皮炎患者皮肤样本中真菌D1/D2 LSU rDNA的序列分析研究显示，患者皮肤中马拉色菌属仍为主要菌属，占63.2%～72.7%，其中限制马拉色菌和球形马拉色菌在患者和健康人中含量均最高，而二者的含量比在不同严重程度患者皮肤中具有差异，其中轻度特应性皮炎患者最高[含量比=(3.1～3.4)∶1]，高于中度和重度特应性皮炎患者[含量比分别为 (2.1～4.1)∶1和 (1.1～1.4)∶1][17]。此外，患者皮肤中非马拉色菌属酵母菌的多样性增加，并且与病情严重程度呈正比，其中白念珠菌、阿萨希毛孢子菌、异常维克汉姆酵母等酵母菌在患者中检出率增高。主坐标分析显示，健康人、轻中度患者和重度患者在PCoA维度上具有差异，说明真菌微生态的改变与疾病严重程度相关[17]。

银屑病是慢性炎症性皮肤疾病，病因包括遗传易感性和环境暴露等。既往皮肤细菌微生态的研究已证实，银屑病的发生与溶血性链球菌定植和葡萄球菌超抗原激活T淋巴细胞相关，而其他可能的相关微生物还包括金黄色葡萄球菌、马拉色菌、白念珠菌和人乳头瘤病毒等[18]。Alekseyenk等[18]研究显示，银屑病患者皮肤细菌微生态的丰度及均衡度均较正常人降低 (P<0.01)，β多样性分析则显示患者皮损处的微生态组内差异高于健康对照，提示患者皮肤的压力环境会对正常菌群进行筛选。另一项基于鸟枪法宏基因组学测序 (shotgun metagenomics sequencing)的研究发现，银屑病与葡萄球菌含量增加相关，并且两株含葡萄球菌分泌抗原基因的菌株在病损部位含量丰富[19]。迄今为止，仅有1项针对银屑病皮肤真菌微生态的研究，结果显示，银屑病皮损部位的真菌微生态的整体丰度升高，而马拉色菌含量较正常对照降低，且球形马拉色菌和限制马拉色菌在患者皮肤中含量偏低，真菌菌落结构PCoA分析显示银屑病患者与健康人群具有差异[20-21]。此外，研究显示马拉色菌定植水平与银屑病面积与严重程度指数评分 (psoriasis area and severity index, PASI)无明显相关性[22]。

脂溢性皮炎是一种常见的皮肤疾病，表现为红斑上覆着油腻的黄色鳞屑、结痂，常累及头皮、耳后、眉弓、鼻唇沟和前胸等皮脂腺丰富部位。既往基于培养的研究认为糠秕马拉色菌为脂溢性皮炎的主要致病菌，而分子学研究则显示，与脂溢性皮炎的发生相关的真菌主要是球形马拉色菌和限制马拉色菌，并且与其中特定亚种相关[23]。对脂溢性皮炎患者头皮皮肤的高通量测序研究证实，患者和健康对照头皮中含量最高的真菌分别是担子菌和子囊菌，但患者子囊菌门的支顶孢属和青霉菌属的含量明显升高[24]。Soares等[25]研究发现，脂溢性皮炎患者皮损中限制马拉色菌含量最高，球形马拉色菌次之，合轴马拉色菌、厚皮马拉色菌仅在少数样本中测出，另有3个新马拉色菌属种型与脂溢性皮炎的发生有关。令人意外的是，糠秕马拉色菌遗传物质在皮肤中含量较低，甚至在部分标本中通过高通量测序方法未被检出，但可能受到取材方法等因素影响。[25]。此外，马拉色菌菌种水平微生态结构相近的样本，亚种水平构成仍有较大区别，但亚种与疾病间关系尚需进一步研究[25]。

痤疮为人类最常见的皮肤疾病，以往认为，革兰阳性亲脂性的痤疮丙酸杆菌是导致痤疮发生的关键因素。微生态研究显示，痤疮丙酸杆菌是未治疗痤疮患者和健康人皮肤表面含量最丰富的细菌，系统使用异维A酸或抗生素治疗后，其含量显著下降[26]。然而，Dreno等[27]进行的另一项微生态分析显示，患者面部的痤疮丙酸杆菌的相对含量反而较健康对照低，仅占细菌菌群的不到2%，而葡萄球菌在患者痤疮、脓疱等病损部位的含量较高，与疾病严重度正相关。除丙酸杆菌和葡萄球菌外，马拉色菌在所有痤疮炎性皮损处中均可检测到，是痤疮中真菌菌群的主要成分，其中限制马拉色菌含量最高，提示马拉色菌可能与痤疮的产生有关[28]。此外，Barnard等[29]的宏基因组学研究显示，痤疮患者皮肤微生态中各功能基因间的相互平衡性起到重要作用，其作用甚至高于某些单一菌株的作用。

皮肤慢性溃疡在糖尿病、老年人和免疫受损患者等人群中具有较高致残率和致死率。微生态分析显示，在皮肤慢性伤口中，细菌微生态稳定性降低则愈合速度加快，截肢、伤口恶化或骨髓炎等临床并发症减少；系统性使用抗生素可使微生态稳定性降低，促进愈合[30-31]。此外，皮肤慢性伤口的真菌微生态在不同时间和个体中也具有显著差异，并可提示疾病预后。伤口真菌微生态子囊菌比例升高，愈合时间延长；而出现截肢等临床并发症时，真菌微生态丰度和稳定性均升高，这可能是由于微生态稳定性高伴随生物膜形成，导致愈合不良[32]。

除上述皮肤疾病外，Gupta等[33]对花斑糠疹中马拉色菌的研究显示，与正常皮肤相比，皮损处球形马拉色菌、合轴马拉色菌和糠秕马拉色菌的分离率提高。实时定量荧光PCR分析显示，花斑糠疹皮损处检出率最高的马拉色菌种分别为球形马拉色菌 (95.8%)、限制马拉色菌 (91.7%)和合轴马拉色菌 (50.0%)，均明显高于正常皮肤[34]。然而目前尚无针对花斑糠疹的细菌和真菌微生态研究。

4 总结与展望

人类与细菌、真菌、病毒等微生物的群落长期处于共生关系，微生物在人体生理和免疫功能等方面都发挥重要作用。近年来，皮肤微生态的研究发展迅速，已有较多研究证实细菌微生态与多种炎症性疾病、感染性疾病的发生和慢性伤口的愈合有关。

真菌的微生态研究仅在最近几年才开始引起重视。目前皮肤真菌微生态的研究尚存在取材、DNA提取等方法学上的困难，需要进一步优化研究方法，以得到准确、可靠的数据。皮肤的微生态环境中，真菌与细菌之间具有复杂的相互作用。目前研究已证实，包括马拉色菌在内的多种真菌菌落构成会对银屑病、特应性皮炎、脂溢性皮炎等疾病产生影响，但仍需要更多的大规模对照研究证实。

此外，皮肤真菌感染是常见的皮肤科疾病，皮肤癣菌病、花斑糠疹、黏膜念珠菌病等感染性疾病的发生与真菌微生态之间的关系也逐渐引起学者重视。皮肤和黏膜的真菌感染常见于免疫功能受损人群，例如，HIV感染患者口腔内的细菌菌群结构改变，稳定性降低，而真菌菌群多样性提高，念珠菌、曲霉等机会致病菌含量增多，可能与慢性黏膜真菌感染有关[35]。白念珠菌通过细胞膜Dectin-1蛋白识别，经SYK和CARD9途径介导产生炎症反应[36-37]。研究已证实，dectin-1缺陷小鼠肠道内念珠菌含量提高，其他酵母菌减少，并且肠道炎症反应增强，提示真菌微生态的改变与炎症性肠病的产生密切相关[38]。HIV感染患者以及先天性CARD9、DECTIN1基因缺陷等免疫受损的患者，皮肤真菌微生态的改变与疾病发生的关系有待未来进一步研究。