林木病原菌广谱拮抗菌株的筛选及功能研究

刘彩霞, 焦如珍, 赵京京

1.中国林业科学研究院林业研究所, 北京 100091; 2.湖南省林业科学院, 长沙 410004

林木是森林资源中最重要的组成部分，随着人工林面积的增加和纯林化程度的提高，林木的病害种类逐渐增多，其危害程度也日益加重[1]。在林木的种植过程中做好病害防治工作是保证林木经济效益的重要前提。在林业生产中，常见的林木病害有苗木尖枯病、林木缩顶病、赤枯病、炭疽病、苗木猝倒病、叶枯病、溃疡病等[2]，而引起以上病害的主要病原菌有尖孢镰刀菌(FusariumoxysporumSchltdl.)、拟盘多毛孢菌(Pestalotiopsisapiculatus(Huang.) Huang)、胶孢炭疽菌(ColletotrichumgloeosporiodesPenz.)、腐皮镰孢菌(FusariumsolaniSacc)、杉叶散斑壳(LophodermiumuncinatumDarker)、杉葡萄座壳(BotryosphaeriacunninghamiaeHuang sp.)等[3,4]。这些病原菌不具有寄主专一性，常导致多种植物发生病害。

林木病害的调控原则主要是预防为主、防治结合。在众多防治手段中，生物防治因同时满足林业发展及生态文明建设的综合需求而被广泛关注。目前，植物促生菌(plant growth promoting rhizobacteria,PGPR)在生物防治中效果显著，其在促进植物生长、增加作物产量的同时，还能防治松赤枯病、松赤落叶病、杉木炭疽病、杜仲环剥烂皮病、杨树溃疡病和杨树烂皮病等森林病害[5,6]。洋葱伯克霍尔德氏菌氏(Burkholderiacepacia,BBC)在防治腐霉病、立枯病等均有良好效果[7]。我国生防微生物资源丰富，而筛选出高效的生防菌株则是生物防治的基础。本研究以林地土壤中筛选出的固氮菌株为研究对象，以林木常见病原菌尖孢镰刀菌、腐皮镰孢菌、胶孢炭疽菌、拟盘多毛孢菌为拮抗对象，期望筛选出在林地中定殖能力强、在防治林木病害的同时还能为林木的生长提供营养的多功能复合型广谱拮抗菌株。

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验菌株为103株固氮功能细菌，均由中国林业科学研究院森林土壤室筛选，菌株均经过了固氮基因nifH检测及基础的16S rDNA测序[8]。4种常见林木病原菌来自中国林业微生物菌种保藏中心。病原真菌分别为：尖孢镰刀菌(菌种编号：cfcc 5672)、腐皮镰胞菌(菌种编号：cfcc 88533)、胶孢炭疽菌(菌种编号：cfcc 6913)、拟盘多毛孢菌(菌种编号：cfcc 5143)。提取菌种后开始菌种活化，并进行ITS序列的检测。

1.2 实验方法

1.2.1广谱拮抗菌的筛选 初步筛选采用改良的PDA平板对峙法。将细菌菌液进行涂板培养，待细菌长出后，取直径为1 cm的真菌菌株放置于细菌平板的中央，对照组则是在PDA空白平板中央放置1 cm的真菌菌株。将二者共同培养7 d后分别测量真菌菌株的菌落半径。

抑制能力=[空白平板的真菌菌株半径(cm)-细菌平板的真菌菌株半径(cm)]/空白平板的真菌菌株半径(cm)×100

1.2.2菌株的溶磷能力研究 筛选溶解无机磷的菌株时使用PKO培养基[9]，筛选有机磷的培养基为蒙金娜培养基[10]。在固体培养基平板上用十字法分为4个区域，每个区域中心位置分布1个接种点，每个菌株1个平板4个接种点，培养4 d后，检查菌落及溶磷圈的大小，计算出菌落溶磷透明圈直径与菌落直径的比值[11]。将形成溶磷圈的菌株接种在灭菌的摇瓶培养基中，每个菌株接种3瓶，28℃ 150 r/min摇床培养7 d[12]。使用流动分析仪(Futura爱利安斯法国)测定有效磷含量。

1.2.3菌株的解钾能力研究 以钾正长石粉为唯一钾源，研究各菌株的解钾能力。将平板上形成光滑透明油滴状菌落的菌株接种在灭菌的摇瓶培养基中，每个菌株接种3瓶，28℃ 150 r/min摇床培养7 d，使用原子吸收法(PEAA700 帕金-埃尔默 美国)测定钾含量。

1.2.4拮抗菌拮抗能力验证 综合筛选后的广谱拮抗菌株进行液体验证。采用菌丝球干重法，让细菌对各病原菌进行动态拮抗。将100 mL PDB培养基装入250 mL锥形瓶中，灭菌。空白对照是在培养基中接入1 mL病原真菌和1 mL无菌水；拮抗实验在培养基中接入1 mL细菌和1 mL病原真菌，120 r/min摇瓶培养5～7 d。将菌液进行真空抽滤，将菌丝球60℃烘干至恒重。

抑菌能力=[空白对照中菌丝球干重(g)-拮抗实验中菌丝球干重(g)]/空白对照中菌丝球干重(g)×100

1.2.5菌株的菌种鉴定 首先对菌株进行表观观察鉴定，随后对菌株进行分子鉴定，将其16S rDNA及功能基因gyrB序列与相关菌种进行比对。其中2024菌株参考芽孢杆菌的功能基因gyrB-34F正向引物：5′-ggTgTWRgKgCNgTCgTAAACg-3′；gyrB-977R基因反向引物：5′-CCSgCAgARTCACCCTCTACg-3′。7014菌株参考泛菌的功能基因gyrB01-f正向引物：5′-TAARTTYgAYgAYAACTCYTAYAAAgT-3′，gyrB02-r基因反向引物：5′-CMCCYTCCACCARgTAMAgTT-3′。随后使用GEN III OmniLog全自动微生物鉴定系统对菌株进行生理生化鉴定。

1.3 数据统计分析

使用SPSS 19.0进行方差分析及差异显著性分析，使用MEGA 4.1软件，Bootstrap的NJ法构建系统发育树。使用Sigma Plot(12.5)作图。

2 结果与分析

2.1 广谱性拮抗菌的初筛

通过平板对峙研究得出，拮抗胶孢炭疽菌cfcc 6913菌株(拮抗能力≥80%)的细菌有62株；拮抗腐皮镰孢菌cfcc 88533菌株(拮抗能力≥80%)的细菌有63株；拮抗拟盘多毛孢菌cfcc 5143菌株(拮抗能力≥80%)的细菌有54株；拮抗尖孢镰刀菌cfcc 5672菌株(拮抗能力≥80%)的细菌有56株。综合分析，对4种病原菌均有较强拮抗能力的菌株共有24株。

2.2 溶磷解钾特性

将24株拮抗菌株的溶磷溶钾能力进行了定量实验(表1)。定量实验中溶解无机磷能力最强的菌株为3-i，溶磷量为36.43 mg/L；溶解有机磷能力最强的菌株为1020，溶磷量为4.25 mg/L；解钾能力最强的菌株也为1020，解钾量为6.79 mg/L。共同具有溶解无机磷、有机磷及解钾能力的菌株有1020和2001两株。

表1 溶磷解钾能力研究Table 1 The research of soluble phosphorus and potassium releasing ability.

2.3 初筛菌株的初步鉴定

将含有其他功能的广谱拮抗菌12株进行初步的鉴定分类，提取各菌株的16S rDNA，并进行测序。测序结果表明，9株菌株(1014、1005、1020、2004、2001、2007、3-i、3-s、7001)属于Burkholderia属，菌株1010和2024属于Bacillus属，7014菌株属于Pantoea属。并且从序列分析及形态学比对得出1010和2024可能为同一菌种的不同菌株；1020和2004可能为同一菌种的不同菌株；2001、2007、3-i及3-s可能为同一菌种的不同菌株。所以根据菌株的功能差异及生物信息学数据综合分析，选取1005、1020、2001、2024、7001、7014菌株进行进一步的筛选。

2.4 广谱拮抗菌株的复筛

将预筛选到的6株细菌进行液体复筛结果(图1)表明，2024和7014菌株对4种病原菌均存在拮抗作用。6株细菌对胶孢炭疽菌均有拮抗作用，并且2001和2024菌株对胶孢炭疽菌的拮抗作用高达100%。但6株细菌对尖孢镰刀菌的拮抗能力普遍较弱，拮抗尖孢镰刀菌能力超过10%的只有7014菌株。1020和2001菌株对腐皮镰胞菌没有拮抗作用，而7014对腐皮镰胞菌的拮抗能力最强，拮抗率可达97.82%。1005和7001对拟盘多毛孢菌没有拮抗作用，但1020对拟盘多毛孢的拮抗作用高达100%。

2.5 筛选出的广谱拮抗菌株菌种鉴定

对2024和7014菌株进行菌种鉴定。图2(彩图见封三图版)为两菌株番红染色的显微照片，通过观察可知2024菌株细胞成杆状，7014菌株的细胞形态为短杆状。2024及7014菌株与相关菌种的16S rDNA序列系统发育分析树结果图3，其中图中发育树节点只显示Bootstrap值大于50%数值，上标的“T”表示模式菌株。随后，对两菌株的gyrB功能基因进行扩增，进一步通过功能基因确定其系统发育位置。目的菌株与相关种的gyrB序列系统发育分析结果见图4。菌株2024和7014生理生化特征鉴定结果见表2和表3。根据细胞形态、生理生化数据、16S rDNA序列和gyrB功能基因序列数据多项鉴定分析，2024被鉴定为：枯草芽孢杆菌枯草亚种(Bacillussubtilissubsp.subtilis)；7014被鉴定为成团泛菌(Pantoeavagans)。

图1 广谱拮抗菌株的拮抗能力筛选Fig.1 Inhibitory ability screening of broad-spectrum bacterium.注：不同小写字母表示不同菌株对同一病原真菌的抑菌能力差异显著(P<0.05)。

图2 菌株显微照片Fig.2 Microscopic photographs of strains.(彩图见封三图版)

3 讨论

通过逐步筛选，本研究最终筛选到最具有广谱拮抗杉木病原菌潜力的功能菌株为2024和7014菌株。2024菌株可以溶解无机磷并具有解钾能力、7014菌株具有溶解无机磷的能力。菌种鉴定结果表明2024菌株为枯草芽孢杆菌亚种，7014菌株为成团泛菌。

通过综合分析菌株的拮抗能力及菌株的复合功能，本研究最终筛选到的最具应用潜力的广谱拮抗菌株为2024和7014。通过形态学及生物学信息比对，判定2024菌株为枯草芽孢杆菌枯草亚种，7014菌株为成团泛菌。前人的研究也得到与2024和7014菌株同属的菌种存在拮抗能力，枯草芽孢杆菌被证实能够拮抗柑桔溃疡病[13]、葡萄灰霉病[14]、白菜炭疽病[15]。彭兵等[16]研究表明枯草芽孢杆菌能产生一种抗真菌蛋白FV，可抑制真菌孢子的萌发，并影响菌丝的细胞形态及结构。麻瑞阳等[17]的研究则表明枯草芽孢杆菌的菌株具有高效的解磷解钾能力。前人关于泛菌属的研究表明，泛菌属能够分解木质素、纤维素，具有溶磷固氮特性，这与本研究中针对7014菌株的功能研究结果一致[18,19]。但关于泛菌属拮抗功能的报道较少，其原因可能为：泛菌属的菌株本身就是玉米褐腐病、桑枯萎病、香蕉叶鞘腐败病等的病原菌[20～22]。在生防菌剂的推广应用中，从安全性考虑，会尽量避免使用菌种本身具有致病性的病原菌，所有针对7014菌株的研究需要进行进一步的安全性检测。本研究筛选出较有应用潜力的拮抗菌株，在后续的研究中，我们将继续针对菌株的拮抗物质稳定性、拮抗机理及拮抗菌株在苗木上的应用效果展开研究。

图3 2024和7014菌株16S rDNA全序列为基础的系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree derived from 16S rDNA sequences of strain 2024 and 7014.

图4 2024和7014菌株gyrB功能基因序列为基础的系统发育树Fig.4 Phylogenetic tree derived from gyrB functional gene sequences of strain 2024 and 7014.

试验项目结果试验项目结果试验项目结果试验项目结果细胞形态杆状革兰氏染色阳性形成芽孢+接触酶+氧化酶/VP反应+甲基红反应-柠檬酸生长+明胶水解+硝酸盐还原+β-半乳糖苷酶+精氨酸双水解酶+赖氨酸脱羧酶-鸟氨酸脱羧酶-H2S产生-脲酶-吲哚产生-阴性对照-a-D-葡萄糖+明胶+p-羟基苯乙酸-糊精+D-甘露糖+甘氨酸-L-脯氨酸-丙酮酸甲酯+D-麦芽糖+D-果糖+L-丙氨酸+D-乳酸甲酯-D-海藻糖+D-半乳糖-L-精氨酸-L-乳酸+D-纤维二糖+3-甲基-D-葡萄糖-L-天冬氨酸+柠檬酸+龙胆二糖+D-岩藻糖-L-谷氨酸+α-酮戊二酸-蔗糖+L-岩藻糖-L-组氨酸+D-苹果酸-松二糖+L-鼠李糖-L-焦谷氨酸-L-苹果酸+水苏糖+肌苷+L-丝氨酸+溴代丁二酸+阳性对照+1%乳酸钠+林可霉素-萘啶酸wpH6．0+夫西地酸-盐酸胍w氯化锂+pH5．0+D-丝氨酸-十四烷硫酸钠-亚碲酸钾+D-棉子糖+D-山梨醇+果胶+吐温40-α-D-乳糖-D-甘露醇+D-半乳糖醛酸+γ-氨基丁酸-D-蜜二糖+D-阿糖醇-L-半乳糖酸内酯+α-羟丁酸-β-甲基-D-葡糖苷+肌醇+D-葡糖酸+β-羟基-D，L-丁酸-D-水杨苷+甘油+D-葡萄糖醛酸-α-丁酮酸-N-乙酰-D-葡糖胺+D-葡糖-6-磷酸+葡糖醛酰胺-乙酰乙酸+N-乙酰-β-D-甘露糖胺-D-果糖-6-磷酸+粘酸+丙酸-N-乙酰-D-半乳糖胺-D-天冬氨酸-奎宁酸-乙酸-N-乙酰神经氨酸-D-丝氨酸-糖质酸+甲酸+1%NaCl+醋竹桃霉素-万古霉素-氨曲南+4%NaCl+利福霉素SV+四唑紫w丁酸钠+8%NaCl+二甲胺四环素-四唑蓝-溴酸钠-

注：w表示无法判定。

表3 菌株7014的生理生化实验结果Table 3 Physiological and biochemistry test results of strain 7014.

注：w表示无法判定。

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