葡萄抗霜霉病机制研究进展

乔宝营, 孙雷明, 张 柯, 孙文英*, 黄海帆, 刘崇怀

(1. 河南农业职业学院, 中牟 451450; 2. 中国农业科学院郑州果树研究所, 郑州 450009;3. 河南省农业科学院园艺研究所, 郑州 450002)

葡萄霜霉病由葡萄霜霉病菌引起,遍及世界各葡萄产区,是危害葡萄的重要病害之一。葡萄霜霉病在中国的各葡萄产区均有分布,特别是在多雨潮湿地区,发病更为严重,甚至还会影响翌年病害的发生率[1],给葡萄生产造成严重的经济损失。目前生产上主要通过使用化学杀菌剂防治霜霉病[2],这不仅会因农药残留而降低果品质量,而且还会污染环境,给人们的身体健康造成潜在威胁,所以近年来一些研究者从绿色环保的角度出发,在筛选抗病品种以及培育抗病新品种方面做了大量工作[3-7]。本文结合前人对葡萄抗霜霉病的研究成果主要从植物学特征、生理生化性状、与病害遗传关系以及有关抗霜霉病分子研究三方面分别进行了分析和探讨,希望为葡萄霜霉病抗性的研究与霜霉病防治提供依据。

1 结构抗性

1.1 叶片气孔结构与抗病性

王国英[8]对抗病性不同的葡萄叶片的气孔进行了电镜扫描和光学显微镜观察,发现叶片气孔的密度和结构与葡萄抗霜霉病存在着一定的关系,抗病葡萄叶片气孔小、稀少,气孔周围有白色的堆积物,而感病类型的气孔大、密集;徐红霞等[9]、乔宝营等[10]认为葡萄品种感霜霉病程度与叶片气孔大小和气孔密度呈正相关,叶片气孔密而大时感病,稀而小时抗病,可以利用葡萄叶表气孔密度直接作为霜霉病抗病性鉴定指标之一;刘天明等[11]则认为,葡萄对霜霉病的抗性与气孔开张度、气孔密度无相关性。

1.2 叶片表皮结构、叶背茸毛与抗病性的关系

Boubals[12]认为有些葡萄品种叶片的下表皮多毛,有的下表皮有一蜡质层,这些结构使叶表面不易湿润而使游动孢子不能侵入叶片表皮而发芽;徐红霞等[9]认为葡萄叶背茸毛极密的品种抗霜霉病,因为浓密的茸毛阻挡了病原菌的侵入。

2 生理生化抗性

2.1 过敏性的抗病反应

葡萄对霜霉病的防御反应,最明显的是葡萄具有过敏性坏死反应。过敏性坏死反应是指病菌侵染抗病品种后,被侵入的细胞很快会失去活力而死亡;而侵染感病品种后,被侵细胞却可活很久。有研究表明:过敏性反应的基本特征是细胞内单宁类、酚类化合物和其氧化衍生物的累积,这些物质可能在病菌感染前就已经积累了足够的数量阻止病菌侵入,但是在多数情况下它们是在感染后被诱导产生而积累起来的。王国英[8]的研究表明:瘤枝葡萄中的‘岚-5株系’、‘河岸葡萄’、‘蓝葡萄’,秋葡萄中的‘江秋-2’、复叶葡萄的‘留-8’和‘留-9’、华东葡萄的‘白-13-1’、‘白-35-1’、‘白-36-1’株系以及山葡萄都具有过敏性的抗病反应。Diez-navajas等[13]在研究中发现接种霜霉病病原菌数小时后,抗霜霉病葡萄品种在感染的气孔周围观察到过敏反应,有时候会产生坏死病斑。

2.2 产生毒素的抗病反应

植物抗毒素是指在植物受到机械损伤或各种病原物侵染后,会产生具有一定量的有毒物质,当其累积到一定浓度时可以抑制病菌的发展,植物表现抗性。Abadzhyan[14]用感霜霉病品种与抗病品种做人工接种试验,7 d后经测定发现,抗霜霉病品种产生的植物抗毒素和细胞间有毒物质的毒性比感病品种强,这种毒性使霜霉病菌游动孢子死亡,抑制其感染蔓延至整个叶片。

2.3 酶活性与抗病反应

酶活性与葡萄抗霜霉病有密切的关系,现在研究的酶类主要包括过氧化物酶(POD)[15]、过氧化氢酶(CAT)、多酚氧化酶 (PPO)、超氧化物歧化酶(SOD)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)[16]、几丁质酶(chitinase)[17]、芪合酶(STS)[18]等。Dai等[15]分别观察接种霜霉病菌的感病、中抗和高抗葡萄品种,发现中抗品种接种后5 d检测到过氧化物酶的活性。史娟等[19]、房玉林等[20]的研究表明,过氧化物酶(POD)活性与葡萄对霜霉菌的抗性密切相关,不同抗病性品种叶片感染霜霉病菌后POD活性在升高的速度和幅度上有显著的差异,与感病品种‘乍娜’、‘红地球’相比,抗病品种‘赤霞珠’的POD活性升速快、变化幅度大,而且POD高活性持续的时间长。林玲等[21]对高抗霜霉菌的毛葡萄野生株系接种霜霉病菌后检测其叶片内的POD活性,结果表明POD活性升高幅度明显高于感病的欧美杂种‘醉人香’和‘H-Norris’。而Abadzhyan[14]则研究认为,在受病原菌侵染的局部组织,POD活性升高快,出现坏死斑,感病品种的叶片内POD活性高于抗病品种,并且差异达到极显著水平。齐慧霞等[22]对不同抗性的酿酒品种进行接种鉴定,认为感病品种接种后POD活性呈递增趋势,而抗病品种则呈递减趋势。

吕秀兰等[23]、Perepelitsa等[24]发现,在葡萄未感病时CAT活性与抗病性之间关系不密切,但接种发病后供试葡萄品种CAT活性与霜霉病病情指数呈极显著负相关,认为CAT的活性可作为葡萄品种对霜霉病抗性的一种辅助评价指标。而林玲等[21]认为不论抗病还是感病品种,在接种霜霉病菌后葡萄叶片内CAT活性均呈下降趋势。

葡萄叶片接种霜霉病菌后,抗病品种和感病品种PPO活性有显著的差异,抗病品种在接种后PPO活性不仅升速快、而且幅度大。感病品种接种后的PPO活性则下降[14, 24]。而吕秀兰等[23]的研究表明,PPO活性与葡萄霜霉病病情指数呈极显著负相关。

齐慧霞等[25]研究认为SOD活性在酒葡萄品种间存在着很大的差异,不同品种接种霜霉病菌后的SOD活性均高于接种前,并随着发病程度加重,其活性则呈上升趋势。但接种霜霉病菌后4～12 d内,叶片SOD活性有的呈递减趋势,也有的呈递增趋势。进一步研究发现,在葡萄霜霉菌诱导下抗病品种‘SV6059’体内SOD酶活性6 d内基本恢复到正常状态,其自我调节恢复能力显著大于感病品种 ‘品丽珠’。吕秀兰等[23]则认为,接种前和接种后2 d,供试葡萄品种SOD活性和霜霉病发病指数相关性不显著。林玲等[21]研究了毛葡萄接种霜霉病菌后SOD活性的变化情况,发现供试的5个毛葡萄野生株系、1个毛葡萄与欧亚种杂交后代、两个欧美杂种接种霜霉病菌后SOD活性呈现先上升后下降的趋势。

近年来,苯丙烷代谢与植物抗病性的关系,也引起了人们的重视。Perepelitsa等[24]研究认为PAL活性与葡萄对霜霉菌的抗性呈正相关,随着PAL活性的变化,绿原酸和木质素在抗病品种中积累的速度和量大于感病品种,可能由PAL控制的苯丙烷代谢也是葡萄对霜霉病的抗性机制之一,PAL活性可作为葡萄品种抗霜霉病的一种辅助评价指标。

2.4 氮代谢与抗霜霉病的关系

氮代谢也是抗霜霉病机制研究的一个重要内容。寄主受到病原菌侵染后能够产生病程相关蛋白,这种蛋白可能与抗病基因表达有关。Margaryan[26]研究发现所有感病植株的叶片总氮和蛋白质含量下降。Antonyan等[27-28]认为,对感病品种,健康叶片内天冬氨酸和谷氨酸的含量较高,而被霜霉病菌侵染后这些氨基酸的含量下降,而对抗病品种,被霜霉病菌侵染后叶片内氨基酸的含量反而上升。进一步测定感病和抗病品种的叶片及新梢的蛋白质含量,发现两种类型的蛋白质含量相似。齐慧霞等[25]也认为,随着发病程度加重,葡萄叶片内可溶性蛋白质含量逐渐下降。但也有研究认为葡萄感染霜霉病程度与叶内游离氨基酸含量无显著相关性[11]。因此,可以推测抗病品种和感病品种合成蛋白质的能力明显不同,氮代谢呈现出复杂性变化。

2.5 叶绿素含量与葡萄霜霉病的关系

葡萄品种叶片内叶绿素含量与霜霉病感病程度呈极显著正相关。感病品种叶片内叶绿素含量比抗病品种高,但在发生霜霉病后抗病品种能抑制叶绿素含量的下降,使叶绿素含量很快恢复到正常的状态,即叶片叶绿素总质量分数降幅与叶片病情指数呈显著正相关[29]。葡萄感霜霉病程度与叶绿素a和叶绿素b的总量有密切关系,叶绿素总量越大的品种则越抗病,反之则越感病[6]。但也有研究认为叶绿素a的含量影响品种抗病程度,且效果明显,叶绿素b的含量与抗病性关系不大[30]。

2.6 可溶性糖含量与抗病性的关系

Margaryan[26]认为抗霜霉病葡萄品种叶片中蔗糖含量低,而感病品种叶片中其含量较高;齐慧霞等[22,25]却认为抗病品种叶片内可溶性糖含量高于感病品种,在感染霜霉病后,可溶性糖含量呈下降趋势;但也有研究认为,葡萄对霜霉病的抗性与品种叶内的还原糖、淀粉等含量无显著相关,而外施高浓度蔗糖能显著降低霜霉病菌的致病力[11,31]。

2.7 酚类物质与抗病性的关系

植物组织内的酚类物质为木质素的合成提供大量的前体物质,有利于提高组织的成熟度,增强其抗逆性[32]。Margaryan[26]和Abadzhyan[31]认为高抗霜霉病的葡萄品种,其多酚含量也高。有研究使用高浓度邻苯二酚处理离体叶片,发现其对霜霉病菌有明显的抑制作用,因此认为酚类物质可能是葡萄抗霜霉菌扩展的主要物质[11,30]。

2.8 其他矿质元素与抗病性的关系

葡萄叶片中磷钾养分含量与抗霜霉病也具有一定的相关性,当叶片中磷含量达0.14%,钾含量达2.1%时,叶片发病率比对照降低40%左右[33]。钙钾比例也会影响品种的抗性,钾含量与品种的抗病性呈负相关,葡萄细胞液中Ca/K比是决定抗霜霉病的一个重要因素,Ca/K比随抗病程度而增加[9]。乔宝营等[10]则认为葡萄叶片中氮含量、磷含量、钾含量与霜霉病发病程度关系不显著。

3 与其他葡萄病害的遗传相关性

葡萄霜霉病与其他病害也有一定的抗性遗传关系,刘会宁等研究认为欧亚种品种感霜霉病和黑痘病之间是负相关的关系,但相关性不显著,而欧亚种品种(系)后代对霜霉病和白粉病的抗病性存在极显著相关性[34-36]。另外,胼胝体积累被认为是抵抗霜霉病的反应物之一,H2O2也是一个重要的防御信号,Liu等[37]使用3种中国野生抗病葡萄 (华东葡萄‘Baihe-35-1’, 刺葡萄‘Langao-5’和复叶葡萄‘Liuba-8’)和欧亚种易感品种(‘Pinot noir’),进行了病理学上的研究,通过苯胺蓝染色表明3种中国野生抗病葡萄上有胼胝体积累,‘Baihe-35-1’还具有特殊的荧光光谱,使用3,3-二氨基联苯胺进行比色,在‘Langao-5’和‘Liuba-8上产生了H2O2,这些特征在易感霜霉病的欧亚种‘Pinot noir’上则不存在。

4 分子抗性

随着分子生物学的发展,葡萄抗霜霉病机制的研究已经深入到分子水平。Kim[38]认为葡萄抗霜霉病是由单基因控制,并存在修饰基因;何宁等[39]认为山葡萄抗霜霉病是受一对具有显隐性关系基因控制;李华等[40]、贺普超等[41]、宋润刚等[42]则认为葡萄抗霜霉病为表现数量性状遗传特征的多基因控制,抗病类型中的品种或品系中存在抗病的微效多基因并表现为累加性效应;Luo等[43]用BSA、SCAR和RAPD方法研究了葡萄感霜霉病基因的分子标记,发现RAPD标记OPO10-800与葡萄感霜霉病主效基因紧密连锁,将该DNA片段克隆并测序,并将OPO10-835RAPD标记转化为SCAR标记SCO10-835;此外,还发现RAPD标记OPO06-1500与葡萄抗霜霉病主效基因RPV1紧密连锁,并将此RAPD标记转化为SCAR标记SCO06-1500,这两个SCAR标记均可用于葡萄对霜霉病的抗病与感病性鉴定。Fischer等[44]和Welter等[45]在18号连锁群上定位了一个抗霜霉病的主效基因,在4号连锁群上定位了一个微效基因;Kortekamp等[46]通过差异显示技术对抗病的河岸葡萄和感病的欧洲葡萄进行了研究,发现并分离到一个定位10号连锁群的VRP-1 抗病基因。Marguerit等[47]利用欧洲种‘赤霞珠’与美洲河岸葡萄‘Gloire de Montpellier’的138株杂交个体在12号连锁群定位了2个新的跟霜霉抗性相关的位点Rpv5和Rpv6;Moreira等[48]分别利用‘Moscato Bianco’和V.riparia174个杂交一代,‘VRH3082 1-42’和‘SK77 5/3’94个杂交后代构建了两张葡萄染色体连锁图谱,抗霜霉病的QTLs主要定位在第一张图谱的7、12连锁群上和第二张图谱的7、8、12连锁群上。

在定位葡萄霜霉病抗性QTLs的同时,研究者们也试图克隆得到抗霜霉病的相关基因。Wu[49]等用Solexa测序的方法得到一些可能与抗霜霉病相关的基因和通路,从感病样品中获得15 249个基因,对照中获得14 549 个基因,感病样品与对照的差异表达基因富集的通路涉及核糖体代谢、光合作用、氨基酸与糖代谢以及淀粉和蔗糖代谢,Rpv1、NPR1的同源基因和PR蛋白编码基因与葡萄霜霉病抗病机制有关。Polesani等[50]采用cDNA-AFLP技术分析感病品种‘雷司令’霜霉病感染的叶片,得到804个转录本,这为阐明霜霉病侵染过程的分子机制及识别抑制病原菌的相关基因提供了帮助。王平等[51]获得10个与已知抗病基因相似保守结构域的葡萄抗病基因同源片段(RGA),同时定量PCR分析出RGA1、RGA2、RGA5和RGA23在感染霜霉菌后显著表达,推测可能与葡萄抗霜霉病有关,使得克隆出抗霜霉病基因成为可能。孔祥久等[52]获得葡萄霜霉菌候选效应子RXLR5信号肽,推测可能从葡萄霜霉菌细胞内分泌到胞外的过程中起重要作用。

不同基因型的葡萄对霜霉病的抗性也不同,V.vinifera葡萄对霜霉病敏感,V.rupestris葡萄中抗,V.amurensis葡萄抗霜霉病,圆叶葡萄则对霜霉病完全免疫[53]。Figueiredo等[54]利用基因芯片技术,在121个转录本中,发现代表感病‘Regent’和抗病的 ‘Trincadera’的29个差异表达基因。

5 小结

霜霉病不仅严重影响了葡萄的生长还影响了产量和品质。现今关于葡萄霜霉病抗性的研究虽然取得了一定的进展,但是由于不同葡萄品种(类型)对霜霉病的抗性强弱与其自身的形态结构和生理生化特性有着紧密的联系,所以研究者往往在对葡萄霜霉病抗性的研究方面存在不同的见解。葡萄对霜霉病的抗病性涉及诸多因素,各因素间关系复杂,虽然至今未能确定出葡萄抗霜霉病的决定性因子,但是通过对抗性品种的抗病机制、遗传进程或抗病基因的研究,结合长期杂交育种或转基因的方式,将抗霜霉病性状与葡萄优良性状相结合,培育抗病品种是解决霜霉病的最安全有效、最有前景的方法。