斑马鱼幼鱼生物钟节律行为方法的建立

郑彦文　蔡靖　仲兆民

【摘 要】所有生物体均受到生物钟的调控而产生行为和生理的节律变化，运动行为节律是反应生物节律的最可靠标志。斑马鱼是研究行为学的良好模式动物。为了探讨斑马鱼幼鱼在持续黑暗或者持续光照条件下的行为节律方法，选择发育至5 dpf （受精后天数）的幼鱼，放置于诺达思行为分析仪中，分别采取持续弱光（DD，30 lux）、持续光照（LL，300 lux）以及正常光照黑暗（LD，14小时光：10小时暗）三个光照条件，检测斑马鱼幼鱼连续三天的运动行为变化。结果显示斑马鱼幼鱼在正常光暗条件下显示出明显的昼夜节律，即光照时运动多，黑暗时运动少。而在两个持续条件下均表现出明显的生物钟节律，并且统计算出的周期均在24小时左右。但是持续光照条件（LL）下的平均运动距离要明显高于持续弱光条件（DD）。因此，通过本实验建立起可靠的斑马鱼幼鱼行为节律分析方法，为今后以斑马鱼为模型研究不同光暗条件下生物钟行为提供了良好的实验基础。

【关键词】斑马鱼；生物节律；行为学

中图分类号： R965 文献标识码： A 文章编号： 2095-2457（2018）30-0136-002

DOI：10.19694/j.cnki.issn2095-2457.2018.30.058

Establishment of the Circadian Behavioral Method in Zebrafish Larvae

ZHENG Yanwen， CAI Jing， ZHONG Zhaomin

（Soochow University， Suzhou Jiangsu 215123， China）

【Abstract】All organisms show daily rhythms in behaviour and physiology， and are regulated by the circadian clock. The activity behaviour have been shown to be a reliable marker for ciracdian rhythms. In recent times zebrafish have proven to be a good model system for behavioural studies. In the present study we examined the activity rhythms under different light conditions， such as light-dark cycle （LD） and constant darkness （DD） or light （LL）， in zebrafish. For this， 5 dpf （days after fertilization） larvae were placed into 48 well plate， continous videos were recorded， tracked and analyzed using Noldus behavioral apparatus under normal light-dark cycle （14 h light： 10 h dark）， constant dim light （30 lux） and constant bright light （300 lux）. We measured the changes in locomoter activity for three consecutive days. The results showed that the zebrafish showed synchronised daily rhythms in activity behaviour under light-dark cycle with a diurnal pattern， active during the day and rest during the night. Interestingly， in both LL and DD， the activity behaviour showed circadian pattern with period of ～24 hours. However， the activity was significantly higher under LL， compared to DD condition， which we reason as a direct effect of bright light on the behaviour. This sets a reliable method for analyzing the activity rhythms of zebrafish and established zebrafish as a good model to study circadian rhythms under different light conditions.

【Key words】Zebrafish； Circadian rhythm； Behavior

生物節律（生物钟）是指生物体为了适应由于地球自转引起的昼夜变化而形成的行为、代谢、免疫等多方面的以大约24小时为周期的节律变化过程[1]。生物节律的变化影响到包括人类在内的绝大多数生物的多种生理功能。2017年诺贝尔生理医学奖的获得者主要研究领域即是果蝇的生物钟行为[2]。这也凸显了生物钟研究的重要性。

传统的生物钟研究模式动物主要是小鼠和果蝇，但近些年斑马鱼领域多种遗传学手段出现使得斑马鱼也成为研究生物节律的优良模型[3]。斑马鱼为昼行性动物，因此同小鼠相比，与人类的昼夜节律行为更相近；并且作为脊椎动物模型，同果蝇相比与人类的亲缘关系更近；生物节律的主要控制器在大脑，斑马鱼产卵量高、胚胎体外发育、易于显微注射及胚胎透明的特点，研究者可以很好的利用遗传学手段研究斑马鱼幼鱼大脑的功能，并且可以进行快速、大规模的活体药物筛选[3]。

行为节律是反应动物体生物节律的最明显的特征，在人类、小鼠及果蝇等物种中，持续黑暗条件下的行为节律还能保持近24小时的周期，并持续数天[4]。但是利用斑马鱼研究行为节律的报道却非常少。为了更好的利用斑马鱼作为研究行为节律的模型，本研究分析了斑马鱼幼鱼在多个光暗条件下的行为表现，现报道如下。

1 实验部分

1.1 动物

6-12月龄TUBABC品系野生型斑马鱼成鱼，饲养于苏州大学生物钟研究中心。采用专业的饲养系统（上海海圣工贸有限公司）进行饲养，水温维持在28.5±1℃，pH为7.2-7.6之间，鱼房的光照周期为14小时光照/10小时黑暗，即14L：10D，每天早晚喂食丰年虾，中午喂食干饲料。

1.2 斑马鱼胚胎及幼鱼的获得

第一天晚上将一对斑马鱼成鱼放置于交配盒中，中间用挡板将雌雄分开。第二天鱼房灯亮后将挡板抽掉，一小时后收集胚胎，胚胎放置于E3培养液中，并加入少量甲基纤维素。将未受精胚胎挑出后，剩余胚胎放置于鱼房光暗条件（14L：10D，300 lux），28.5℃培养。待斑马鱼幼鱼发育至5 dpf（受精后天数，days post fertilization）时放于行为仪中。

1.3 幼鱼行为

实验仪器为斑马鱼行为分析仪（Noldus Information Technology）。仪器内有红外高速摄像头，可捕捉每个孔的幼鱼运动参数。将5dpf斑马鱼幼鱼放置于48孔板中，每个孔放置一条幼鱼。每个孔及孔与孔之间的间隙均加满水，但液面需要保持水平，不要凸出来，保证实验中水分蒸发较慢，并且每个孔里的幼鱼不能游到其他孔中。每个孔加入200μl的草履虫液体，去掉48孔板的盖子，将孔板放入行为仪中。选择仪器实时监测功能，分别采取持续弱光（DD，30lux）、持续正常光照（LL，300lux）以及正常光照黑暗（LD，14小时光：10小时暗）三个光照条件进行实验。实验时间为连续三天即5dpf-8dpf。

1.4 结果及统计分析

斑马鱼行为分析仪捕获的数据先用系统自带的分析软件进行分析（Ethovision 10.0 software ，Noldus Information Technology），数据的获取均使用10分钟作为时间间隔。生成的数据表示为平均值±标准误。再使用Matlab软件采用非线性最小二乘最小化方法（nonlinear least-squares minimization method）分析其节律周期和振幅。

2 结果

2.1 三种光照条件下的行为及平均活动量比较

在持续弱光（DD）和持续光照（LL）条件下的幼鱼行为均表现出明显的节律性，即相对的白天活跃，相对的晚上运动较少（图1A， B）。在连续三天的检测时间内，两个条件下的行为结果均有三个波峰及三个波谷，证明为近24小时的周期节律（图1A， B）。而在正常光暗（LD）条件下，幼鱼的活动与是否有光呈明显相关性，有光时活动要显著高于无光时的活动量（图1C）。分别统计LD条件下的白天（L）及夜晚（D）行为，并且与DD及LL条件下的平均活动量比较，结果表明DD条件下的平均活动量最低，LD条件下的黑暗时间的活动量其次，然后是LL条件下的平均活动量，LD条件下的白天活动量最高（图1D）。

2.2 持续弱光（DD）及持续光照（LL）条件下的周期及振幅比較

经过分析LL条件下周期为23.35±0.11小时，DD条件下的周期为23.58±0.10小时，均为近24小时的周期节律。LL条件下的相对振幅1.05±0.03，DD条件下为1.16±0.03。

图1三种光暗条件下的行为变化及平均活动量比较。（A）持续弱光（30lux，DD）条件下的行为节律。（B）持续光照（300lux，LL）条件下的行为节律。（C）正常光暗（LD）条件下的行为变化。（D）三种条件下的平均活动量比较。数据表示为均值±标准误。

3 结论

通过本实验很好的建立起了斑马鱼幼鱼的行为节律方法。无论是持续黑暗还是持续光照条件下，斑马鱼幼鱼均表现出明显的节律行为，并且周期均在24小时左右。另外利用正常光暗条件实验可以检测光照或黑暗时斑马鱼幼鱼的活动量差异。本研究为今后以斑马鱼为模型研究生物钟行为提供了良好的实验基础。

【参考文献】

[1]安扬，徐璎.哺乳动物昼夜节律机制研究进展[J].生命科学，2015，27（11）：1372-1379.

[2]Wang， H. Perfect timing： A Nobel Prize in Physiology or Medicine for Circadian Clocks[J].Science Bulletin， 2018， 63：398-401.

[3]仲兆民，张淑青，王晗.斑马鱼生物钟分子遗传学和基因组学研究进展[J].生命科学，2015，27（11）：1364-1371.

[4]梅龙，桑迪，张二荃.生物钟研究方法综述：追求长程、实时的记录[J].中国生物化学与分子生物学报，2018，34（10）：1021-1029.