微波辅助提取黑豆皮花青素的工艺优化

袁园 张潇 张凯 杨刚

摘要：以酸性乙醇为提取剂，采用微波辅助法提取黑豆皮中的青花素，先研究了提取液的pH值、乙醇浓度、温度、料液比、时间等单因素实验的影响，再在单因素实验的基础上，采用正交实验，筛选出了在各因素共同作用下的最佳提取工艺。最佳工艺条件为：乙醇浓度70%，料液比1：40，提取温度为70℃，时间为8min。测得花青素含量为4. 887 mg/g黑豆皮。该提取工艺稳定可行，可为黑豆花青素的提取提供参考。

关键词：黑豆;花青素;微波提取;正交实验

中图分类号：TS202.3

文献标识码：A

文章编号：1674-9944（2018）2-0171-03

1 引言

黑豆（ Black Soybean），豆科植物，又称黑大豆、乌豆等，原产于中国。黑豆富含蛋白质、氨基酸、脂肪、维生素等多种营养成分，并且有活血、利水、祛风、清热解毒、滋养健血、补虚乌发的功能。花青素是黑豆皮色素的主要成分之一，是一种非常好的抗氧化剂，具有多种生理活性功能。黑豆皮花青素作为一种天然色素，在酸性条件下稳定，天然无毒，是一种安全的、健康的食品添加剂[1，2]。

微波辅助技术具有设备简单、提取效果好、时间短、效率高的优点，微波辐射容易破坏细胞，从而使有效成分在短时间内从细胞内溶出。目前，微波辅助法已经是提取植物中有效成分的热点，已运用于提取多种植物的有效成分，但利用微波辅助法对黑豆中花青素的提取工艺的研究却鲜有报道。因而本实验利用微波辅助法提取黑豆中的花青素，以原花青素含量为指标，在pH值、乙醇浓度、温度、料液比、时间5个单因素实验的基础上，通过正交实验确定黑豆中花青素的最佳提取条件。

我国黑豆资源丰富，以黑豆为原料，开发利用花青素及相关产品具有便利的条件，以期为黑豆中花青素的工业化提取提供参考，也为进一步研究花青素的生物学活性及在保健食品和食品添加剂的应用提供一定的理论依据[3，4]。

2 材料与方法

2.1 材料与试剂

黑豆皮，安国市御颜坊中药材有限公司;原花青素标准品，上海金穗生物科技有限公司，乙醇，盐酸，甲醇，香草醛，均为分析纯。

2.2 仪器与设备

Cary 60紫外分光光度计，美国安捷伦仪器有限公司产品;AL104电子天平，梅特勒托利多仪器（上海）有限公司产品;PHSJ-3F型实验室pH计，上海仪电科学仪器股份有限公司;SHZⅢ型循环水真空泵，上海亚荣生化仪器厂;MAS-3微波萃取器，上海新仪微波化学科技有限公司。

2.3 溶液的配制

2.3.1 标准品的配制

精密称取0. 1000 g的原花青素标准品，用蒸馏水配制成0.1 mg/mL的标准品水溶液。

2.3.2 显色剂的配制

（1）香草醛 甲醇溶液。准确称取1.000 g香草醛，用甲醇定容至100 mL，配制成浓度为1%（ W/V）的香草醛甲醇溶液。

（2）盐酸甲醇溶液。用移液管量取15. 00 mL浓盐酸，用甲醇稀释定容至100 mL，配制成15%（V/V）的盐酸 甲醇溶液。

（3）显色剂。1%（ W/V）的香草醛甲醇溶液：15%（ V/V）的盐酸甲醇溶液=1：1。

2.4 方法

2.4.1 黑豆皮中花青素的提取工艺

黑豆皮干燥到恒重，粉碎一过60目筛一准确称取1g一加入一定酸度的乙醇溶液一微波提取2次一抽滤一合并提取液一加入提取液定容至50 mL- 530 nm[5，6]处测吸光度。

2.4.2 标准曲线的绘制

分别精确吸取2、4、6、8、10 mL已配置好的标准品溶液至100 mL容量瓶中，加入一定量的显色剂，并用1%的盐酸甲醇溶液稀释至刻度，在530 nm下，以蒸馏水作为参比，测定吸光度，绘制标准曲线。以香草醛的浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，并作回归处理，得回归方程y =O.0711X+O. 0051，r=0.9991。

2.4.3 黑豆皮中花青素的测定

用移液管精准吸取1 mL提取液，置于25 mL容量瓶中，用相應浸提液稀释至刻度，以蒸馏水作参比在波长530 nm处测定吸光度，根据标准曲线算出花青素提取液的浓度，按照以下公式计算黑豆皮中的花青素的质量。

黑豆皮中的花青素的质量m=cVK

其中，c为测量液中花青素的浓度（μg/mL）;V为提取液体积（mL）;K为提取液稀释的倍数。

2.4.4 单因素实验

以预处理过的黑豆皮粉为原料，利用微波提取法，以香草醛含量为指标，经单因素实验初步考察提取液的pH值、乙醇体积分数、提取温度、料液比、提取时间5个因素对黑豆皮中花青素的质量的影响。

用2 mol/L的HC1调节50%的乙醇溶液的pH值分别为0.5、1.O、1.5、2.O、2.5、3.O，料液比1：25 （g/mL），设置仪器参数为60℃，10 min，300 r/min，研究提取液的pH值对花青素含量的影响。

分别以pH =1的体积分数为40%、50%、60%、70%、80%的乙醇为提取剂，料液比1：25（ g/mL），设置仪器参数60℃，10 min，300 r/min，研究乙醇浓度对花青素含量的影响。

以pH=l的70%乙醇溶液作提取剂，料液比1：25（ g/mL），时间分别为5、6、7、8、9、10 min，60℃，300r/min，研究提取时间对花青素含量的影响。

以pH=l的70%乙醇溶液作提取剂，料液比1：25（ g/mL），300 r/min，8 min，分别设置温度至40、50、60、70、80c，研究提取温度对花青素含量的影响。

以pH=l的70%乙醇溶液作提取剂，以料液比1：30、1： 40、1： 50、1： 60、1：70（ g/mL），微波处理8min，60℃，300 r/min，研究料液比对花青素含量的影响。

2.4.5 正交实验

根据单因素实验结果，选取微波提取温度、提取时间、乙醇体积分数、料液比为实验因素，采用正交表L9（34）进行正交实验，以波长530 nm处的吸光度为考察指标，确定黑豆皮青花素的最佳提取条件。

3 结果与分析

3.1 浸提液pH值对花青素提取效果的影响

花青素在酸性条件下较为稳定，因此浸提液pH值对青花素的提取影响较大，在实验中提取液颜色为酒红色，测得其吸光度情况见图1所示。

从图1中可以看出，色素的吸光度随pH值的增大，呈现先增大后建校的趋势，可能是色素结构发生改变的缘故。由图可知，在pH=l时，吸光度最大，提取效果最好，因而确定浸提液的pH值为1.O。

3.2 乙醇浓度对花青素提取效果的影响

花青素易溶于水、甲醇、乙醇、稀酸、稀碱中，考虑了溶剂的特性，出于绿色化学的角度，选用了乙醇的水溶液作为提取剂，不同体积分数的乙醇对花青素提取效果的影响如图2。

从图2中可以看出，在乙醇浓度为70%是的提取效果最好，浓度继续上升时，吸光度反而减小，这是由于乙醇浓度太大，溶液的极性减小，黑豆皮中花青素的溶解度降低，且更多的醇溶性杂质被溶出。因而在此次实验中，确定提取液的乙醇浓度为70%。

3.3 提取时间对花青素提取效果的影响

由图3可知，随着提取时间的延长，青花素的浓度也随之增加，到8 min时达到顶点，然后下降。分子在微波场的作用下能产生瞬时极化并迅速生成大量的热能，促使细胞破裂，使细胞液溢出并扩散至溶剂中。时间过长，可能会破坏提取液中的有效成分。在此次实验中，提取时间确定为8 min。

3.4 提取温度对青花素提取效果的影响

由图4可知，花青素浓度随着温度的增加而增加，在60℃时最高，提取效果最好，再升高温度，温度随之下降，这是由于随着温度升高，热运动加速，花青素更易流出。但是在过高温度的条件下，花青素的结构遭到破坏，降低提取效果，因此在提取过程中要避免温度过高。

3.5 料液比对花青素提取效果的影响

由图5可知，在料液比为1：40时提取效果最好，1：30时由于料液比太小，有效成分还未完全溶出就已达到饱和，而再增加料液比时，由于有效成分已完全溶出，溶剂增加，浓度变小。在此次实验中，选取料液比为1： 40。

3.6 正交实验

在考察了浸提液pH值、乙醇浓度、提取时间、提取温度、转速、料液比对黑豆皮青花素提取效果的基础上，设计正交实验对乙醇浓度（A）、提取时间（B）、料液比（C）、提取温度（D）等因素进行4因素3水平L9 （34）正交实验，以优化其提取工艺（表1～3）。

从表2和表3可以看出乙醇浓度对黑豆皮花青素的提取效果有显著的影响，其最佳提取工艺为A2 82 C2 D3，乙醇浓度为70%，8 min，料液比为1：40，提取温度为70℃。影响提取黑豆皮青花素的各因素主次顺序为A>C>D>B，即乙醇浓度>料液比>温度>时间，乙醇浓度的影响最为显著（P<0.05）。

3.7 花青素含量测定

精确称取黑豆皮粉末lg，在最佳工艺条件下微波提取2次，抽滤后定容至100 mL，准确吸取2 mL提取液于25 mL容量瓶中，用浸提液稀释到刻度，以蒸馏水作为参比，于530 nm处测定吸光度，由标准曲线求得青花素的含量。重复此实验3次（表4）。

4 结论

以原花青素为指标，利用紫外分光光度法测定黑豆中花青素的含量，通过单因素及L9 （34）正交实验，分析料液比、乙醇浓度、温度、微波处理时间对黑豆皮中花青素含量影响，并优化最佳提取条件，经分析可知微波提取黑豆青花素的最佳工艺为乙醇浓度70%，料液比1：40，溫度为70℃，提取时间8 min。经计算，花青素的含量为4. 887 mg/g黑豆皮。微波辅助提取黑豆中花青素体现出了明显的优势，温度低、时间短、效率高，可为黑豆中花青素的开发应用以及工业化生产提供理论依据。

参考文献：

[1]陈玉，庄纯，夏增务，等，黑豆皮红色素的提取工艺及稳定性研究[J].福建师大福清分校学报，2012，113（5）：69～77.

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[3]郭婕，胡利宗，李俐俐，等，黑豆豆芽中大豆异黄酮微波提取工艺研究[J].大豆科学，2015，34（3）：493～496.

[4]郭婕，刘中华，袁淑培，等.黑豆中大豆异黄酮微波提取工艺的优化[J].食品工业科技，2015，36（5）：255～357.

[5]陈长应.黑豆皮中花青素的提取及测定的研究[J].中国调味品，2013，38（12）：91～94.

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[7]王少波，杜永峰，姚秉华.pH示差法测定黑豆皮中的花青素[J].化学分析计量，2008，17（1）：46～47.

[8]张海辉，李金凤，段玉清，等.板栗壳原花青素提取及其稳定性研究[J].食品科学，2011，32（8）：5～9.