HPLC法测定新型降糖药安奈格列汀片含量

姜业朝， 龚爱琴， 张宇航

(扬州工业职业技术学院,江苏 扬州 225127)

*联系人：龚爱琴，女，1974年出生，博士研究生，副教授。研究方向：仪器分析、药物分析。

提出了一种高效液相色谱法测定安奈格列汀含量的新方法。采用VP-ODS(250 mm×4.6 mm,5 μm)色谱柱，以10.0 mmol/L磷酸二氢钾-乙腈缓冲液(pH=5.5)(60∶40)为流动相，流速为0.80 mL/min，检测波长为248 nm。结果发现，安奈格列汀的质量浓度为2.0 μg/mL～50.0 μg/mL时，进样量与峰面积呈良好的线性关系，线性方程为A=103.91c+23.45，r=0.999 8，平均回收率为99.71%，RSD为0.50%(n=9)。实验结果表明，该方法结果准确、专属性强，适用于安奈格列汀的质量控制及含量检测。

安奈格列汀；降糖药；HPLC；测定

新型降糖药安奈格列汀(anagliptin)结构式如图1所示，2012年在日本首次上市，属于二肽基肽酶-4抑制剂(DPP-4)，对DPP-4酶具有强效、高选择性抑制作用，目前中国尚在临床阶段。在日本进行的一项临床研究表明，安奈格列汀具有显著改善血糖水平的效果，与阿卡波糖等联合使用能更有效地改善血糖控制，并且不会使患者体重增加或发生低血糖现象[1，2]，因此，该药具有良好的应用前景。但文献调研显示，该药含量的测定方法国内外报道很少。目前，药物含量测定方法应用较多的是HPLC[3-6]。本研究拟采用HPLC法测定安奈格列汀含量，旨在为药物的质量控制提供方便有效的检测方法。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

大连伊利特高效液相色谱仪，带紫外检测器和N2000数据处理工作站；上海美普达1801紫外-可见分光光度计；上海精科雷磁pH S-25酸度计。

图1 安奈格列汀结构式

安奈格列汀标准品和药片(批号20160801、20160802、20160803，规格100 mg/片)；乙腈(色谱纯)、磷酸二氢钾(分析纯)，购自国药集团化学试剂有限公司。

1.2 溶液配制

1.2.1 流动相

10 mmol/L磷酸二氢钾(取磷酸二氢钾0.68 g，加水溶解并稀释至500 mL，用氢氧化钾调节pH值至5.5)-乙腈缓冲液，体积比为60∶40，用0.45 μm微孔滤膜过滤脱气后使用。

1.2.2 对照品溶液的制备

精密称取安奈格列汀对照品适量，加水溶解并定量稀释，制成每1 mL中含安奈格列汀0.1 mg的溶液，作为对照品溶液。

1.2.3 供试品溶液的制备

取安奈格列汀药片5片，研磨均匀。取样品粉末适量，加水溶解并定量稀释，制成每1 mL中约含安奈格列汀0.1 mg的溶液，过滤。取续滤液作为供试品溶液。

1.2.4 阴性对照溶液的制备

根据安奈格列汀片制剂配方，配制不含安奈格列汀的阴性对照粉末。精密称取阴性对照粉末适量，按照“供试品溶液的制备”方法制备阴性对照溶液。

1.3 色谱条件

色谱柱：Shimadzu VP-ODS(250 mm×4.6 mm,5 μm)；柱温：20 ℃；检测波长248 nm；进样量20 μL。

1.4 实验方法

取各项目下溶液，进样20 μL，注入液相色谱仪，在色谱条件下测定，记录色谱图，按外标法以峰面积计算其含量。

2 结果与讨论

2.1 测定波长的选择

实验中扫描了安奈格列汀的吸收光谱曲线，结果如图2所示。由图2可知，安奈格列汀在248 nm处有最大吸收。因此，选择248 nm作为HPLC中的检测波长。

图2 安奈格列汀吸收曲线

2.2 流动相的选择

实验中分别尝试了甲醇、乙腈、甲醇-水、乙腈-水，但发现出峰效果均不理想。改为磷酸二氢钾-乙腈溶液为流动相后，出峰效果慢慢改善，并且峰形随两者配比的变化而不同。当磷酸二氢钾-乙腈溶液体积比为60∶40时，峰形对称且峰较窄(见图3)。实验中选用磷酸二氢钾(10 mmol/L磷酸二氢钾溶液，用氢氧化钾调节pH至5.5)-乙腈溶液=60∶40为流动相。

2.3 工作曲线与检出限

取对照品适量，分别配成2.0、5.0、10.0、20.0、30.0、40.0、50.0 μg/mL的标准溶液，在1.3色谱条件下，分别精密量取20 μL注入液相色谱仪，记录色谱图，以峰面积(A)与浓度(c)进行线性回归。结果表明，安奈格列汀质量浓度在2.0 μg/mL～50.0 μg/mL线性关系良好，回归方程为A=103.91c+23.45，r=0.999 8。

图3 磷酸二氢钾-乙腈(60∶40)为流动相时色谱图

取5.0 μg/mL的标准溶液逐级稀释，测定方法的检出限与定量限。结果发现，检出限(S/N≥3)为0.1 μg/mL，定量限(S/N≥10)为0.3 μg/mL。

2.4 方法的精密度、再现性与稳定性

取线性关系中的20.0 μg/mL溶液连续进样6针，以峰面积评价方法的精密度。结果表明，6个峰面积的RSD为0.33%，表明方法具有较好的重现性。

由3个不同人员分别取同一份供试品，按照色谱操作条件测定安奈格列汀含量，每人平行测定2次，用外标法计算含量，测得数据分别为100.2%、99.81%、99.21%、99.48%、99.70%、100.5%，RSD为0.21%，表明方法的再现性较好。

取批号为20160801供试品溶液，在10 h内每隔2 h分别测定一次峰面积。结果显示，峰面积的RSD为0.26%，表明样品溶液在10 h内稳定性良好。2.5 回收率实验

取阴性对照品溶液，加入适量对照品，分别制成质量浓度为10.0、20.0、30.0 μg/mL的样品溶液，每种溶液平行配制3份，测定其峰面积，用外标法计算回收率。结果显示，回收率分别为99.20%、99.51%、99.43%、99.77%、100.5%、99.40%、99.69%、99.51%、100.61%。平均回收率为99.71%，RSD为0.50%，表明方法的回收率较好，共存组分干扰小。2.6 样品测定

用本方法对3批样品进行了测定，结果含量分别为标示量的99.5%(20160801)、100.5%(20160802)、99.3%(20160803)。

3 结论

提出了一种高效液相色谱法测定新型降糖药安奈格列汀含量的新方法，对流动相的种类进行了优化。精密度、稳定性、回收率实验均表明，方法的准确度高、重现性好，可以用于实际样品分析，从而拓展了安奈格列汀含量测定方法。

[1] Shinya Nishio,Mariko Abe,Hiroyuki ito.Anagliptin in the treatment of type 2 diabetes:safety,efficacy,and patient acceptability[J].Diabetes,Metabolic Syndrome and Obesity:Targets and Therapy,2015(8):163-171.

[2] Hidetaka Hamasaki,HidekatsuYanai.The development of angioedema in a patient with type 2 diabetes due to a noveldipeptidyl peptidase-IV inhibitor,anagliptin[J].Int J Cardiol,2013,168:e106.

[3] 倪赞,谢循策,刘萌.HPLC法测定保健食品中非法添加的12种镇静安神类化学药物[J].中国卫生检验杂志,2014,24(17):2491-2493.

[4] 陈吉之,闫超.饲料中9种磺胺类药物的HPLC法快速分离与检测[J].中国医药工业杂志,2015,46(8):892-894.

[5] 马兰.色谱法在药物分析中的应用[J].天津药学,2014,26(1):65-67.

[6] 李娜,朱平,王志敏.HPLC法测定注射用头孢西丁钠中有关物质[J].山西化工,2008,28(3):29-32.