肌肽抗衰老机制的研究进展

钱 雯 ，骆 丹，周炳荣

1 衰老的特征

衰老是生物随着时间推移，导致细胞功能逐渐退化自发的持续过程，是机体内所有细胞、组织、器官和整体普遍存在的现象。各种因素的个体作用及其相互作用均在机体的老化过程中起作用。随着人口逐渐老龄化，对机体衰老机制的研究也逐步深入。皮肤作为机体最外在的器官，首先反应出机体的衰老，所以越来越得到关注。皮肤老化可以表现为皮肤变薄，皮下脂肪减少，产生皱纹、松弛、粗糙、干燥等。皮肤老化是多种原因共同作用的结果，尽管现阶段对其产生机制知之甚少，但尚有一部分机制已经被证实，如DNA损伤修复、线粒体机制、细胞凋亡、细胞自噬及氧化损伤等均在皮肤老化过程中起到重要作用。虽然皮肤衰老不能停止，但是减轻这些因素的毒性作用可以减慢衰老。目前发现肿瘤的发生也与衰老息息相关，大量研究证实，许多药物抗肿瘤的同时兼有抗衰老作用。

2 肌肽的生化作用及生理特征

肌肽在1900年由俄罗斯化学家Gulewitch和Amiradzibi在牛肉提取物中发现，它是由β-丙氨酸和L-组氨酸组成的一种二肽，自然存在于机体多种组织中，尤其在肌肉及脑组织中含量丰富。肌肽主要在骨骼肌、心肌及某些特定的大脑区域由肌肽合成酶合成，通过肌肽酶降解为β-丙氨酸及L-组氨酸[1]。其最常见的变异体为甲基化类似物如鹅肌肽、蛇肌肽，两者均通过L-组氨酸的咪唑环被甲基化形成，除了结构相同，也表现出类似的生物活性。肌肽、鹅肌肽、蛇肌肽统称为组氨酸二肽。决定肌肽在肌肉中含量的因素主要有纤维类型、性别、年龄、运动量以及食物等。肌肽的作用广泛，有抗氧化、金属离子螯合、酸碱缓冲、抗衰老等作用。在动物实验研究中发现，肌肽对许多老年相关性的疾病均能起作用，如促进伤口愈合，对阿尔茨海默病、帕金森病、脑卒中以及糖尿病肾病均有益等。

3 肌肽抗衰老机制

3.1 抗自由基损伤

自由基学说已经是现在所公认的有关皮肤衰老的机制。氧参与生物体呼吸链过程，但同时也是产生氧自由基（reactive oxygen species，ROS）的来源。正常情况下自由基的产生与清除处于平衡状态。随着年龄的增长及抗氧化酶活性的减退，氧自由基产生增多而清除作用减弱，导致皮肤中ROS过多的积聚，使细胞膜、蛋白质及核酸受到损伤。ROS能够激活体内的丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）通路而最终破坏皮肤结构，MAPK通路包括4条途经分别是细胞外信号调控蛋白激酶（extracellular signal-regulated protein kinase，ERK）、c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）、细胞外信号调控蛋白激酶5（extracellular signal-regulated protein kinase5，ERK5）、p38 丝裂原活化蛋白激酶（p38 mitogen-activated protein kinase，p38MAPK）。其中JNK可以激活活化蛋白-1（AP-1），进而刺激基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）产生。MMPs是一组锌依赖内肽酶，在许多生理和病理过程包括皮肤老化中扮演着复杂的角色。MMP-1可以降解真皮组织中完整的胶原蛋白及弹性蛋白，同时MAPK通路的激活可以抑制前胶原DNA的产生，最终导致真皮结构的破坏，形成皮肤的老化[2]。所以清除自由基或者减少自由基的产生对抗衰老至关重要。

3.1.1 清除自由基作用 肌肽能够清除自由基及一些氧化产物，从而起到抗皮肤衰老作用。肌肽对机体的其他组织同样具有清除自由基的效果。Aydın 等[3]在通过高脂饮食并低剂量链脲佐菌素注射诱导2型糖尿病大鼠中发现其ROS、丙二醛（malondialdehyde，MDA）及高级糖基化终产物（advanced glycosylation end products，AEGs）的产生显著增加，这时肌肽的添加可以显著减少氧化产物及糖化产物如ROS、MDA及AEGs等的积累，从而减轻组织器官的损伤。Walsh等[4]证实热量限制可以通过减少自由基损伤从而延长寿命。肌肽也能够缓解ROS带来的DNA氧化损伤[5]，其可能机制是，在三价铁离子存在条件下，减弱AEGs导致DNA裂解；也可能通过隔绝ROS及脂质过氧化产物如羟基壬烯醛（hydroxynonenal，HNE）和丙二醛来使DNA损伤达到最小。选择性的与金属离子如Cu+、Fe2+螯合及咪唑环的作用可以减少羟自由基的产生。

3.1.2 减少线粒体功能损伤 肌肽可以通过保护线粒体功能及减少ROS的产生延缓衰老。线粒体是ROS产生的重要场所，过量ROS 的积累会导致线粒体DNA（mtDNA）突变。由于其缺少组蛋白修饰及缺乏修复机制，所以相对基因组DNA来说有更高的突变率。mtDNA的损伤导致电子传递及氧化磷酸化过程中的缺陷，最终导致三磷酸腺苷（ATP）生成减少，引起细胞供能不足，进而导致皮肤衰老。Ouyang等[6]发现氧葡萄糖剥夺-再恢复能够显著减少线粒体膜电位并且增加ROS水平，然而肌肽存在的情况下可以逆转膜电位减少同时抑制ROS的产生。这也是肌肽调节线粒体能量代谢的机制。Corona[7]等证实了肌肽对线粒体功能有很强的保护作用，可能与肌肽的抗自由基损伤有关。

3.1.3 抗氧化作用 肌肽通过减少关键中间产物—活性羰基物质的产生或阻止其与蛋白质结合等以抑制进一步的氧化产物形成，最终减少黑素及脂褐素产生。ROS参与脂质过氧化反应，即与细胞膜中的多不饱和脂肪酸反应，生成活性羰基类物质如MDA、HNE等。这些活性基团接着又可以参与蛋白质氧化反应，导致蛋白质羰基化，交联的羰基化蛋白很难被溶解，进而在细胞内积聚，最终导致老年色素等物质的形成，这些均是造成皮肤粗糙变黑的原因。人体成纤维细胞中的蛋白质羰基会随着机体年龄的增长而不断增加[8]。

光老化过程中长波紫外线(ultraviolet A, UVA)可以诱导醛类物质，如HNE等的产生，醛类通过修饰皮肤中的弹性蛋白并且使其对弹性蛋白酶的消化作用产生抵抗。实验表明，肌肽能够清除HNE，MDA，甲基乙二醛，乙二醛等活性羰基类物质，而对HNE的清除最为明显[9]。在多个实验中均可以观察到肌肽的添加能够有效降低处理组中MDA的水平[10,11]。肌肽通过与蛋白质羰基的作用形成蛋白质-羰基-肌肽化合物来抑制细胞内蛋白质羰基的毒性作用。肌肽可以阻止4-羟基壬烯醛（4-HNE）与弹性蛋白的结合，从而减轻脂质过氧化带来的损伤[12]。Aydın等[10]通过将肌肽添加到D-半乳糖诱导的衰老小鼠中，证实了肌肽能够显著降低由衰老导致的蛋白质羰基的增加，这可能与肌肽的抗氧化及抗糖化作用有关。

3.2 抑制端粒缩短

端粒是染色体末端重复的DNA序列，通过保护染色体免受降解及抑制端端融合来维持染色体的稳定。端粒的长度与细胞分裂次数成正比，在出生时端粒长度最长，随着年龄的增长便会逐渐缩短。正常人体细胞有一定的分裂次数限制[13]，所以端粒的缩短被认为与机体的衰老相关。而端粒酶能够使端粒延长。

Ait-Ghezala等[14]证实了肌肽能够激活端粒酶，抑制端粒缩短，进而延缓衰老。同时还发现将多种天然产物如肌肽、维生素D3、绿茶提取物、甘氨酸等以一定的浓度及比例添加，能够起到协同及扩大作用。Shao等[15]发现成纤维细胞在含20 mmol/L肌肽的培养液中生长可以减慢端粒的缩短并且可以延长细胞寿命，当细胞处于增殖抑制状态时，肌肽的存在可以减少端粒碎片的积累，故而认为减少端粒缩短及端粒DNA损伤是肌肽能够延长寿命的机制之一。

3.3 抗糖基化作用

蛋白质糖基化是蛋白质翻译后修饰的重要过程之一。含醛基的糖和蛋白质的氨基残基在无酶条件下发生连接首先形成席夫碱（Schiff base），再经过一段时间的重新排列后形成较为稳定的早期糖基化产物即酮氨类化合物（amadori 产物），amadori产物再经过脱水重排后形成高活性的羰基化合物如丙二醛（malondialdehyde，MG）等，再与蛋白质的游离氨基反应通过环化作用、氧化作用及脱水形成更为稳定的高级糖基化终产物（advanced glycosylation end products，AGEs）。这一过程称为美拉德（Maillard）反应[16]。随着年龄增长，AGEs也在积累，对组织器官造成损伤[17]。真皮组织主要由成纤维细胞产生的胶原纤维、弹性纤维及细胞外基质构成。弹性蛋白及胶原蛋白参与非酶糖基化反应生成AGEs，形成胶原蛋白及弹性蛋白的交联产物，氧化胶原刚开始能够被胶原酶所降解，随着胶原的交联逐渐加重，胶原蛋白的溶解性下降[18]，难溶解的胶原蛋白的堆积，导致组织的通透性下降，造成细胞间营养及代谢产物的交换障碍，最终导致皮肤弹性下降及皱纹的产生。

肌肽可以与体内的活性物质反应，保护蛋白质不被糖基化，同时肌肽可以与已经发生糖基化的蛋白质产物作用，阻止糖基化蛋白质的进一步交联。肌肽抑制AEG产生可能是由于在与活性二羰基化合物的反应中，由β-丙氨酸衍生来的自由氨基酸基团竞争蛋白质的氨基酸基团。AGEs在体内以多种结构形式存在，其中较为常见的就是羧甲基赖氨酸（carboxymethyllysine，CML）、戊糖素等。在一项双盲安慰剂对照随机临床试验中，Houjeghani等[19]发现口服肌肽制剂能够显著降低CML水平，与之类似的血清戊糖素水平也得到了明显改善。Aydın 等[10]在其实验中发现肌肽的加入能够降低由D-半乳糖诱导的衰老小鼠中AGE及ROS等的水平。

3.4 使衰老的细胞恢复活力

早在1994年，McFarland 和 Holliday[20]在实验中观察到肌肽对成纤维细胞的生长、形态以及寿命的作用。他们发现高浓度的肌肽（20～50 mmol/L）可以延缓衰老，并且可以使已经衰老的成纤维细胞恢复活力。在肌肽存在的情况下，分裂次数已经达到接近Hay fl ick分界线的成纤维细胞可以呈现出一种不衰老的形态，而将这些细胞转移到不含肌肽的培养液中时，它们很快又恢复衰老形态。虽然肌肽不能使Hay fl ick分界线延长，但它能够延长细胞的寿命。类似的，在加速衰老的小鼠模型中，补充标准的饮食可以减少其老年性特征的发展，并使小鼠的平均寿命延长20%，但是对小鼠的最大寿命的延长作用不是很明显[21]。

3.5 抗肿瘤作用

肿瘤与衰老的发生密不可分，随着年龄的增长，肿瘤的发生率也显著提高，这可能与DNA的损伤修复功能随着年龄的增长逐渐减退有关。同时癌基因可以诱导细胞的衰老。科学家们发现即使在有氧存在的情况下，肿瘤细胞仍旧会优先利用葡萄糖进行有氧糖酵解产生乳酸，以产生ATP，这一现象被称为 Warburg 效应。所以可以推断抑制肿瘤细胞糖酵解活动可以抑制肿瘤的增生。Ding等[22]通过测量人肝癌细胞的存活率发现，肌肽可以显著抑制肿瘤细胞的生长，并且这一现象表现为浓度依赖性。并且由此推断肌肽将来或许可以用于抑制人肿瘤细胞的增殖，达到抗肿瘤的目的。肌肽也可以显著抑制人宫颈腺癌细胞的增殖，并且对人宫颈腺癌细胞的抑制作用强于鳞癌细胞。Bao等[23]通过一系列实验证实，肌肽抑制人宫颈腺癌细胞增殖的作用可能与其参与调节线粒体功能，糖酵解通路及细胞周期有关。

3.6 调节细胞自噬及细胞凋亡

细胞自噬及凋亡与衰老及衰老相关性疾病密切相关。自噬是细胞通过溶酶体对细胞内代谢产物，如异常修饰蛋白，蛋白质聚合物及损坏的细胞器等的自我消化过程。因此，自噬能够控制细胞内蛋白质及细胞器的质量以维持细胞内环境的稳定。在许多衰老的模型中可以观察到自噬行为的减少，而通过药理和遗传方法上调自噬活动可以缓解与年龄相关的疾病的发生，但是另一方面，过度的自噬反而会加速衰老。所以合理的调控自噬系统在抗衰老的研究中至关重要。沉默信息调节因子-1（silence signal regulating factor-1，SIRT-1）可以促进溶酶体形成，以激活自噬功能，加速清除细胞内的代谢产物，延缓衰老。类似的细胞凋亡与衰老也是相互调节，相互影响，而肌肽可以通过合理调节细胞凋亡以减慢衰老进程。虽然目前关于肌肽对自噬系统调节方面的报道比较少，但是相信这一理论可以在后续的实验中逐步得到证实。

3.7 其他

肌肽能通过许多其他的途径来抑制衰老。肌肽是雷帕霉素类似物[24]，哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）通路的激活是导致细胞衰老的驱动力，肌肽可以通过抑制mTOR信号通路来加强对细胞周期的阻滞，以抑制由UVA引起的真皮成纤维细胞的衰老表型的出现[25]。

综上所述，肌肽的抗衰老机制主要是抗氧化、抑制端粒缩短、抑制线粒体损伤、抗糖基化、抗肿瘤等作用，不仅能够抑制细胞衰老，还能够延缓与衰老相关的一些疾病的发生发展。虽然目前已有一些研究，但是在肌肽抗皮肤老化方面的研究还不是很多。关于肌肽对细胞自噬、细胞凋亡及与去乙酰化酶的调节的研究作用，也需要在后续实验中进一步验证。相信随着研究的深入，肌肽能够广泛运用于各领域。