响应面法优化红豆纳豆的发酵工艺

2018-01-31高辰哲刘丹怡李明洋李海龙韩建春

中国酿造 2018年1期

王琳,高辰哲,刘丹怡,刘琳,李明洋,李海龙,韩建春,2*

(1.东北农业大学食品学院,黑龙江哈尔滨 150030；2.黑龙江省绿色食品科学研究院,黑龙江哈尔滨 150000)

红豆是一种药食同源的食物,味甘、无毒,在日常生活中较为常见[1-2],其具有丰富的营养物质和显著的抗氧化作用,种皮中含有多酚、单宁、皂苷等多种生物活性物质[3-4],以红豆为原料制作的食品深受大众喜爱。在饮料行业中,红豆可做成多种饮料[5-8],如红豆乳饮料[9]、红豆纤维饮料[10]等。红豆发酵食品也广受喜爱,如红豆果醋[11]、红豆果酒[12]、红豆米酒[13]等。

纳豆是一种大豆发酵食品,含有卵磷脂、维生素E、多胺等成分[14]。现有研究表明,纳豆具有降血压、溶血栓、抗菌、抗肿瘤、预防骨质疏松等功能[15]。虽然纳豆是一种成本低廉、营养丰富的功能性食品,但因其具有的特殊氨臭味不易被广大消费者接受[16-17]。而红豆具有较高的水分、粘多糖及总氨基酸含量,可以作为纳豆制作原料[18]。

接种量、接种种龄对纳豆芽孢杆菌(Bacillus subtilis natto)的生长状态具有重要影响[19]。本研究以红豆为原料,选取优选高产纳豆菌株,采用单因素法探索接种量、接种种龄及发酵时间对红豆纳豆品质的影响,并采用响应面法优化了红豆纳豆发酵工艺,旨在创新红豆纳豆发酵工艺,开发新型纳豆产品,以期为红豆相关产品的开发提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

红豆:黑龙江齐齐哈尔绿谷米业；纳豆芽孢杆菌(Bacillus subtilisnatto)1.1086:中国食品发酵工业研究所；纤维蛋白原(凝固物含量为59%)、尿激酶标准品(1 240 IU/支):中国药品生物制品检定所；葡萄糖(分析纯):中国浙江玉环红星生化制品厂。

固体斜面培养基:蛋白胨1%,牛肉膏0.5%,氯化钠0.5%,琼脂1.5%,葡萄糖1%,pH 7.2～7.4,121℃灭菌20 min。

液体培养基:蛋白胨1%,牛肉膏0.5%,氯化钠0.5%,葡萄糖1%,pH 7.2～7.4,121℃灭菌20 min。

二级培养基:蛋白胨1%,牛肉膏0.5%,氯化钠0.5%,葡萄糖1%,pH 7.2～7.4,121℃灭菌20 min。

1.2 仪器与设备

BL610电子天平:上海静天电子仪器有限公司；DK-98-I电子恒温水浴锅:江苏省金坛市江南仪器厂；TGL-16C台式离心机:上海安亭科学仪器厂制造；303A型电热恒温培养箱:泸南电炉烘箱厂；LDZX-50KB立式电热压力蒸汽灭菌锅:上海申安医疗器械厂。

1.3 方法

1.3.1 红豆纳豆制作工艺流程及操作要点

操作要点:将纳豆芽孢杆菌接种到固体斜面培养基上,37℃培养12 h使其活化后,用接菌环挑两环纳豆芽孢杆菌接种到装有液体培养基的试管中37℃培养8 h,之后接种到二级培养基,200 r/min的摇床18℃恒温培养24 h,备用。

选取颗粒饱满的优质市售红豆作为原料,清水冲洗2～3遍去除杂质,用3倍质量的清水浸泡,以吸水后质量增加2倍为宜。在相同规格的纱布袋中装入洗净后沥干水的湿豆子,每个袋子装500 g,121℃灭菌30 min,重复灭菌两次,第二次灭菌时,将首尾两端袋子对调,保证充分灭菌及蒸煮。于无菌操作台中冷却至45℃后,将一定量菌液接入到处理过的红豆中,搅拌均匀,使菌液充分与红豆接触,于37℃恒温培养箱培养一定时间。将发酵好的成品放入4℃的冰箱中,后熟24 h,得成品。

1.3.2 红豆纳豆发酵条件的单因素试验

选择接种量、接种种龄、发酵时间进行单因素试验,考察接种量(2%、4%、6%、8%、10%)、接种种龄(9 h、12 h、15 h、18 h、21 h)、发酵时间(16 h、17 h、18 h、19 h、20 h、21 h、22 h、23 h、24 h)对红豆纳豆中纳豆激酶酶活力和红豆纳豆感官品质的影响。

1.3.3 响应面法优化红豆纳豆发酵条件

根据单因素试验结果,选取接种量(A)、接种种龄(B)和发酵时间(C)3个因素为自变量,以感官评分(R)为响应值,设置3因素3水平进行响应面优化试验对红豆纳豆发酵条件进行优化,响应面试验因素与水平如表1所示。

表1 红豆纳豆发酵条件优化响应面试验因素与水平Table 1 Factors and levels of response surface experiments for fermentation conditions optimization of red bean natto

1.3.4 检测方法

纳豆激酶酶活力的测定[20-21]:取适量尿激酶标准品,用0.01 mol/L的磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline,PBS)将尿激酶标准品配制成浓度为100 IU/mL、150 IU/mL、200 IU/mL、250 IU/mL、300 IU/mL标准溶液,用微量进样器注入平板孔内,测定溶圈直径,计算溶圈面积,以尿激酶酶活力(x)为横坐标,溶圈面积(y)为纵坐标,绘制尿激酶标准曲线。称取新鲜红豆纳豆1 g加入20 mL无菌去离子水中,充分振荡后进行过滤,取10 μL点样于纤维蛋白平板,10 min后37℃保温18 h,测定溶圈直径,计算溶圈面积,由尿激酶标准曲线计算出被测样品中纳豆激酶酶活力。

1.3.5 感官评价

在本学院选择20名学生(10男10女)组成感官评价小组,采用双盲法从颜色、香气、滋味、组织形态4个方面进行打分。随机对样品进行数字编码,排列样品顺序,满分100分,感官评分标准见表2。

表2 红豆纳豆感官评分标准Table 2 Sensory evaluation standards of red bean natto

2 结果与分析

2.1 尿激酶标准曲线的绘制

以尿激酶酶活力(x)为横坐标,溶圈面积(y)为纵坐标,绘制尿激酶标准曲线,结果见图1。

图1 尿激酶标准曲线Fig.1 Standard curve of urokinase

由图1可知,尿激酶标准曲线的线性回归方程为y=0.005 2x+0.879 6,相关系数R2=0.999 1,表明尿激酶酶活与溶圈面积线性关系良好。

2.2 单因素试验

2.2.1 接种量对红豆纳豆发酵的影响研究

考察接种量对红豆纳豆中纳豆激酶酶活与感官品质的影响,结果如图2所示。

图2 接种量对纳豆激酶酶活力与感官品质的影响Fig.2 Effect of inoculum on nattokinase activity and sensory quality

由图2可知,随着接种量的增加,纳豆激酶酶活力和感官评分均呈现先增加后下降的趋势。当接种量为6%时,产品中纳豆激酶酶活力达到最大值,为1 148 U/g,感官评分为93分；当接种量为8%时,酶活力为1 112 U/g,感官评分为94分。接种量在2%～8%范围内,感官综合评分呈上升趋势；当接种量＞8%,感官评分开始下降。这可能因为当接种量过小时,菌体则无法在发酵液内充分生长,接种量达到6%时,发酵液中营养成分被充分利用,纳豆激酶活力达到最大；当接种量＞6%时,红豆基质中的营养物质不足以维持芽孢杆菌快速增殖,从而抑制了相对酶活力[22-23]。此阶段感官评分呈现上升趋势,说明增加纳豆激酶接种量有助于红豆纳豆品质的提升,接种量＞8%时感官评分开始下降,可能是因为过多的纳豆激酶阻碍了体系的氧气传递和菌体获得营养物质,影响了红豆纳豆的品质。综合比较,选择接种量6%作为最适接种量。

2.2.2 接种种龄对纳豆激酶酶活的影响

考察接种量对红豆纳豆中纳豆激酶酶活与感官品质的影响,结果如图3所示。

图3 接种种龄对纳豆激酶酶活力与感官品质的影响Fig.3 Effect of inoculation age on nattokinase activity and sensory quality

纳豆芽孢杆菌培养10～15 h处于对数生长期,菌体生长旺盛,有利于缩短微生物生长动力曲线中延迟期的时间。由图3可知,随着接种菌龄的增长,纳豆激酶酶活力整体呈先增加后下降的趋势,而感官评分先增加后趋于平稳,当接种种龄为15 h时,纳豆激酶酶活力达到最高值,为1 147 U/g；当接种种龄为18 h时,感官评分达到最高,为94分。这可能是因为接入发酵液内的菌种处于对数生长期,即菌体处于旺盛生长阶段,短时间内会生成大量的纳豆激酶,具备较高的酶活力。当接种种龄为18 h时,菌体结束对数增长期,此时菌体的细胞含量最高,纳豆激酶酶活力开始下降,但发酵速度依然较高,感官品质最佳。综合比较,因此选取接种种龄为18 h的纳豆芽孢杆菌作为发酵菌株。

2.2.3 发酵时间对红豆纳豆发酵的影响

考察接种量对红豆纳豆中纳豆激酶酶活与感官品质的影响,结果如图4所示。

图4 发酵时间对纳豆激酶酶活力与感官品质的影响Fig.4 Effect of fermentation time on nattokinase activity and sensory quality

由图4可知,随着发酵时间的延长,纳豆激酶酶活力和感官评分整体均呈先增加后下降的趋势,当发酵时间为22h时,产品红豆纳豆的纳豆激酶酶活力和感官评分均达到最大值,分别为1 058 U/g和94分。原因可能是在较短的发酵时间内,微生物不能完全利用红豆的营养物质进行增殖生长,而过长的发酵时间会造成红豆基质中剩余的营养物质不足以维持纳豆芽孢杆菌快速增殖及大量纳豆激酶合成,从而导致纳豆激酶酶活力降低。因此,确定最适发酵时间为22 h。

2.3 响应面法优化红豆纳豆发酵工艺

单因素试验结果表明接种量、接种种龄与发酵时间均对纳豆激酶酶活力及红豆纳豆感官评分具有影响作用,与现有研究结果一致[24-25]。在单因素试验结果的基础上,选取接种量(A)、接种种龄(B)和发酵时间(C)为影响因素,以感官评分(R)为响应值,根据响应曲面法试验设计原理,设计3因素3水平的二次回归方程来拟合因素和指标(响应值)之间的函数关系,确定最优发酵工艺参数,响应面试验设计及结果见表2,方差分析结果见表3。

表2 红豆纳豆发酵条件优化响应面试验设计及结果Table 2 Design and results of response surface experiments for fermentation conditions optimization of red bean natto

利用Design Expert 8.0.6软件对表2试验数据进行多元回归拟合,获得二次多项回归模型方程为:

表3 响应面试验结果方差分析Table 3 Variance analysis of response surface experiments results

由表3可知,方程因变量与自变量之间的线性关系明显,该模型极显著(P＜0.01),失拟项不显著(P＞0.05),并且该模型R2=98.99%,R2adj=97.70%,说明该模型与试验拟合良好,自变量与响应值之间线性关系显著,可以用于该反应的理论推测。由F值大小可以推断影响红豆纳豆感官品质的各因素主次顺序为:C＞A＞B,即发酵时间＞接种量＞接种种龄。一次项A和交互项AB、BC对红豆纳豆感官评分的影响显著(P＜0.05)；一次项C、交互项AC和二次项A2、C2对红豆纳豆感官评分的影响极显著(P＜0.01)。其他因素对红豆纳豆感官评分的影响不显著(P＞0.05)。

利用Design Expert 8.0.6软件,作出各因素对红豆纳豆感官评分的响应面分析图,考察所拟合的响应曲面的形状,分析接种量、接种种龄、发酵时间对红豆纳豆感官评分的影响,结果见图5。

图5 接种量、接种种龄和发酵时间的交互作用对红豆纳豆感官评分影响的响应面及等高线Fig.5 Response surface plots and contour line of effects of interactions between inoculum,inoculation age and fermentation time on sensory evaluation of red bean natto

由图5可知,接种量与发酵时间、接种量与接种种龄、接种种龄与发酵时间之间均有一定的交互作用,最佳预测点在试验考察范围内。因此,该二阶模型具有良好的拟合度,能真实地描述各因素与响应值之间的关系。接种量、接种种龄、发酵时间与红豆纳豆感官评分有显著的相关性,表现为曲面较陡,其中发酵时间对红豆纳豆感官评分影响最大。结合等高线的疏密程度可知,接种量与接种时间的交互作用影响更显著,接种量与接种种龄、接种种龄与发酵时间两两之间有一定的交互作用,但交互作用的影响不如接种量与接种时间的交互作用影响显著。

为获取最大感官综合值,采用联合求解法确定最佳发酵工艺条件为:接种量6.03%、接种种龄18.00 h、发酵时间21.58 h。为符合实际生产需求,将最佳发酵工艺条件修正为接种量6%、接种种龄18 h、发酵时间21.5 h,在此发酵工艺条件下,理论预测感官评分为97分。

为验证试验结果的可信度,采用同样工艺条件进行3次红豆纳豆的平行发酵试验,得到红豆纳豆感官评分的平均值为97.7分,与理论预测值差异不明显,测定纳豆激酶酶活力平均值为1 140 U/g。表明该模型准确可靠,利用该模型在红豆纳豆生产实践中进行预测是可行的。

3 结论

本实验采用单因素试验和中心组合设计试验,利用响应面分析法优化红豆纳豆发酵工艺条件,最终得到优化发酵工艺条件为:接种量6%、接种种龄18 h、发酵时间21.5 h,在此工艺条件下,发酵得到的红豆纳豆具有纳豆的香味,滋味独特,色泽诱人,黏液量丰富,感官评分为97.7分,纳豆激酶酶活力为1140U/g,与响应面法预测值差异不明显,验证了试验模型的可行性,为红豆产品开发及红豆纳豆的产业化生产提供参考。

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