响应面试验优化诺丽果黄酮微波辅助提取工艺

崔 鹏,贾增杰,李瑞杰

(1.黄河水利职业技术学院环境与化学工程系,河南 开封 475004；2.开封市绿色涂层材料重点实验室,河南 开封 475004)

诺丽又名四季果,用于医药方面已有上千年时间[1-2]。诺丽果中的成分对很多病症具有明显的效果,如抗氧化、抗真菌、抗病毒、抗肿瘤、抗衰老、降血压、糖尿病、自身免疫系统疾病、心血管疾病、痤疮等[3-5]。

黄酮类物质的提取方法有很多种,目前比较常见的有浸提法、萃取法、酶解法、超声法、微波法等。其中浸提法较为成熟,但提取缓慢,所需溶剂量过多,提取效率低。酶解法效率有所提高,但提取时间仍然较长。超声法提取速度快、溶剂使用量少、操作简便,但黄酮提取纯度不高[6-7]。萃取法消耗成本较大,现在还在研究阶段。微波提取法能够减少溶剂使用量[8-10],且大大提高提取效率,因此,本试验将单因素试验和响应面试验设计优化法相结合,研究诺丽果黄酮物质的微波辅助最佳提取工艺,以期建立一种高效、清洁、经济、实用的提取方法[11-13]。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

诺丽果:中国海南；芦丁标准品(纯度≥98%):中国药品生物制品鉴定所；无水乙醇(分析纯):安徽安特食品股份有限公司；亚硝酸铝(分析纯):焦作市化工三厂；氢氧化钠、硝酸铝(均为分析纯):天津市恒兴化学试剂制造有限公司；过氧化氢(分析纯):天津市富宇精细化工有限公司；硫酸亚铁(分析纯):天津市大茂化学试剂厂；水杨酸(分析纯):天津市永大化学试剂有限公司；1,1-二基-2-苦基肼自由基(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)(分析纯):上海如吉生物科技股份有限公司。

1.2 仪器与设备

TU-1810紫外可见分光光度计:北京普析通用仪器有限公司；ISO9001超声微波组合反应系统:南京先欧仪器制造有限公司；SHZ-D(Ⅲ)循环水真空泵:河南智诚科技发展有限公司；FA2004N电子天平:上海精密科学仪器有限公司；101-1A电热鼓风干燥箱:天津市泰斯特仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 微波辅助提取

将诺丽果洗净、自然风干后切成片状,放在烘箱中110℃干燥至质量恒定,研磨并过200目筛,置于棕色瓶备用。参照廉琪等[14-16]的方法,取一定量的样品,加入相应体积分数的乙醇,搅拌并静置15 min,在不同功率条件下,选择不同的提取时间,制得待测样品液。

1.3.2 芦丁标准曲线的绘制与黄酮提取率计算

准确称取10.000 0mg芦丁标准品,配制成质量浓度为0.2000mg/mL的标准溶液。移液管移取0、2.50mL、5.00mL、7.50 mL、10.00 mL、12.50 mL此溶液于25 mL容量瓶,依次加入5%NaNO2溶液1.00 mL、10%Al(NO3)3溶液1.00 mL和4%NaOH溶液10.00mL,每次加入试剂后均摇匀静置5min,定容于25 mL容量瓶中,摇匀并静置15 min。于波长505 nm处测定吸光度值。诺丽果中总黄酮质量浓度按照芦丁标准曲线回归方程进行计算。黄酮提取率计算公式如下:

式中:Y为样品中黄酮提取率,mg/g；C为诺丽果中黄酮类化合物的质量浓度,mg/mL；V1为稀释体积,mL；V2为样品溶液体积,mL；m为样品质量,mg；V3为取样体积,mL。

1.3.3 诺丽果中总黄酮的提取单因素试验

乙醇体积分数对诺丽果黄酮提取率的影响:固定液料比30∶1(mL∶g),微波提取时间3 min,微波功率400 W,在乙醇体积分数分别为10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%条件下进行提取试验,探讨不同乙醇体积分数对诺丽果黄酮提取率的影响。

液料比对诺丽果黄酮提取率的影响:固定乙醇体积分数50%,微波提取时间3 min,微波功率400 W,在液料比分别为10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1、70∶1、80∶1(mL∶g)条件下进行提取试验,探讨不同液料比对诺丽果黄酮提取率的影响。

提取时间对诺丽果黄酮提取率的影响:固定乙醇体积分数50%,液料比50∶1(mL∶g),微波功率400 W,于微波提取时间分别为1 min、2 min、3 min、4 min、5 min条件下进行提取试验,探讨不同微波提取时间对诺丽果黄酮提取率的影响。

微波功率对诺丽果黄酮提取率的影响:固定乙醇体积分数50%,液料比50∶1(mL∶g),微波提取时间3 min,于微波提取功率分别为100W、200W、300W、400W、500W、600W、700 W条件下进行提取试验,探讨不同微波提取功率对诺丽果黄酮提取率的影响。

1.3.4 响应面优化试验设计

参照蒋益花等[17-19]的方法,依据单因素试验结果,采用(Box-Behnken design,BBD)法设计4因素3水平的试验,因素分别为乙醇体积分数(A)、液料比(B)、微波辅助提取时间(C)、微波功率(D)；-1、0、1(代表每个自变量的低、中、高水平)；诺丽果中黄酮的提取率(Y)作为响应值,因素与水平编码见表1。

表1 诺丽果黄酮提取工艺优化响应面试验因素与水平Table 1 Factors and levels of response surface experiments for extraction process optimization of flavonoids from Noni

1.3.5 测定方法[20-21]

(1)DPPH自由基清除率的测定

配制质量浓度0.200 0 mg/mL的DPPH溶液,放至冰箱避光保存备用。取不同质量浓度样品2.00 mL,加入已配制的DPPH溶液,摇匀,暗处反应30 min。以体积分数100%的乙醇为参比,在波长517nm处测吸光度值。DPPH自由基清除率计算公式如下:

式中:Ai为DPPH溶液吸光度值；Ax为样品液和DPPH溶液吸光度值；Ae为不含DPPH溶液时样品液吸光度值。

(2)·OH清除率的测定

采用水杨酸比色法测定羟基自由基去除率[22-23]。取不同浓度梯度样品1.00 mL,加入2.00 mL FeSO4,1.50 mL水杨酸,再加入0.10 mL H2O2,摇匀,置于暗处30min。蒸馏水为参比,在波长510nm处测定吸光度值。·OH清除率计算公式如下:

式中:A0为生成的羟基自由基溶液吸光度值；A1为样品液和生成羟基自由基溶液吸光度值；A2为样品液吸光度值。

2 结果与分析

2.1 芦丁标准曲线

图1 芦丁标准曲线Fig.1 Standard curve of rutin

由图1可知,芦丁标准曲线线性回归方程为:A=9.3857C+0.004 4,相关系数R2=0.999 8,表明二者线性关系良好。

2.2 单因素试验结果

2.2.1 乙醇体积分数对诺丽果黄酮提取率的影响

图2 乙醇体积分数对诺丽果黄酮提取率的影响Fig.2 Effect of ethanol concentration on the extraction rate of flavonoids from Noni

由图2可知,黄酮提取率随乙醇体积分数的增大呈现增加后减少的趋势。乙醇体积分数为50%时,提取率最大。推测其原因可能是水的加入使样品充分溶胀,使样品和溶剂的接触面积增加,导致了黄酮的提取率也增加。因此,选择乙醇体积分数为50%。

2.2.2 液料比对诺丽果黄酮提取率的影响

图3 液料比对诺丽果黄酮提取率的影响Fig.3 Effect of liquid-solid ratio on the extraction rate of flavonoids from Noni

由图3可知,黄酮提取率随液料比的增大呈现增加后减少的趋势。液料比为50∶1(mL∶g)时提取率最大。因此,选择液料比为50∶1(mL∶g)。

2.2.3 微波提取时间对诺丽果黄酮提取率的影响

图4 微波辅助提取时间对诺丽果黄酮提取率的影响Fig.4 Effect of microwave-assisted extraction time on the extraction rate of flavonoids from Noni

由图4可知,黄酮提取率随微波提取时间的延长呈现增加后减少的趋势。微波提取时间为3min时,提取率最大。由于微波时间较长时,乙醇被蒸干情况严重,导致提取率下降。因此,选择微波时间为3 min。

2.2.4 微波功率对诺丽果黄酮提取率的影响

图5 微波功率对诺丽果黄酮提取率的影响Fig.5 Effect of microwave power on extraction rate of flavonoids from Noni

由图5可知,黄酮提取率随微波提取功率的增大呈现增加后减少的趋势。微波提取功率为300 W时,提取率最大。推测是由于提取温度随着提取功率的增大而升高乙醇挥发的越快,从而影响试验效果。因此,选择微波功率为300 W。

2.3 响应面法优化工艺条件

2.3.1 响应面试验设计与结果

表2 诺丽果黄酮提取工艺优化响应面试验设计与结果Table 2 Design and results of response surface experiments for extraction process optimization of flavonoids from Noni

续表

2.3.2 模型的建立及方差分析

用Design-Expert8.0.6软件将模型进行分析,得到诺丽果中黄酮提取率以及所选4个因素编码值的回归方程为:

显著性检验和方差分析结果见表3。

表3 多元回归模型方差分析Table 3 Variance analysis of multiple regression model

续表

由表3可知,失拟项P=0.221 3,说明相对于纯误差失拟不显著(P＞0.05)。模型P=0.000 1说明模型极显著。获得模型线性回归系数R2=0.9169,说明91.69%响应值的变化是由独立变量决定,只有8.31%的总变异系数不能由该模型来解释。此外,模型的变异系数(coefficient of variation,CV)相对较低(6.27%),证明该试验值有较高的精密度及可靠性。综上所述,该模型拟合度符合数理统计学原则,诺丽果中黄酮提取的最佳工艺可以用此方程预测。根据F值的大小,得出黄酮成分提取率受各因素的影响次序:微波功率(D)＞液料比(B)＞乙醇体积分数(A)＞微波提取时间(C)。

2.3.3 响应面分析

参照王燕等[24-26]的方法,用Design-Expert8.0.6软件绘制以黄酮提取率为响应值的各因子的响应曲面图,并研究其交互作用,发现乙醇体积分数和液料比、乙醇体积分数和提取时间、液料比和提取时间三组交互作用相对较弱；而乙醇体积分数和微波功率、提取时间和微波功率、液料比和微波功率三组交互作用较强,具体如图5所示。

图5 乙醇体积分数、提取时间、液料比与微波功率交互作用对黄酮提取率影响的响应曲面与等高线Fig.5 Response surface plots and contour line of effects of interaction between ethanol concentration,extraction time,liquid-solid ratio and microwave power on flavonoids extraction rate

由图5可知,随着乙醇体积分数增大提取率也增大,且在乙醇体积分数为50%时提取率最大,超过50%后开始下降,微波功率呈先上升后下降的趋势。由其等高线图可以看出,等高线呈椭圆形,说明乙醇体积分数与微波功率的交互影响较为显著。随着提取时间的增加,提取率也呈增加趋势,且在3 min处达到最高值,而后逐渐下降,提取时间与微波功率对提取率的影响较大,表现为曲线较为陡峭。由等高线图可知,等高线呈椭圆的趋势显著,说明二者交互作用影响较为显著。液料比的影响趋势也相似,随着液料比的增大,提取率升高,在50∶1(mL∶g)处达到最高值,而后提取率开始降低,液料比与微波功率对诺丽果提取率的影响相对最大,表现为曲线更为陡峭。由等高线图可以看出,等高线为更扁的椭圆形,说明微波功率与液料比对诺丽果黄酮提取率交互作用相当显著。综合分析发现,液料比与微波功率的交互作用最为显著。

2.4 最优工艺及验证试验

对多元二次方程进行求解和分析,得出微波辅助法提取诺丽果中黄酮的最佳工艺条件为乙醇体积分数50%,微波辅助提取时间3min,溶剂和诺丽果的液料比50∶1(mL∶g),微波功率300 W,模型预测黄酮提取率为26.204 mg/g。检验优化模拟结果,确定最佳工艺条件为乙醇体积分数50%、微波提取时间3 min、液料比50∶1(mL∶g)、微波功率300 W,做5次平行样,计算平均值为25.981 mg/g,与模型预测值基本一致,说明所得模型可以用来预测诺丽果中黄酮提取率。

2.5 抗氧化试验结果

通过试验得出,诺丽果黄酮提取液质量浓度为8.00mg/mL时对DPPH自由基、·OH去除能力达到最大,分别为92.8%、82.8%,说明诺丽果提取物对DPPH自由基及·OH具备较好的去除能力。

3 结论

经Design-Expert8.0.6优化,检验确定最佳工艺条件为乙醇体积分数50%,微波辅助提取时间3 min,液料比50∶1(mL∶g),微波功率300 W,在此条件下,黄酮提取率平均值为25.981 mg/g。

诺丽果黄酮提取液质量浓度为8.00mg/mL时对DPPH自由基、·OH去除能力达到最大,分别为92.8%、82.8%,说明其抗氧化能力较强。

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