电针百会、神庭穴对缺血再灌注损伤大鼠学习记忆能力及海马CA1区嘌呤受体P2X7表达的影响①

黄佳，宋长明，杨敏光，李建鸿，黄盛，柳维林，陶静,2,3，陈立典,2,3,4

1.福建中医药大学康复医学院，福建福州市350122；2.福建省康复技术协同创新中心，福建福州市350122；3.康复医疗技术国家地方联合工程研究中心，福建福州市350122；4.国家中医药管理局中医康复研究中心，福建福州市350122

脑卒中是全球第二大致死病因及成人致残的首要原因。在一些发达国家，67.3%～80.5%的脑卒中归因为缺血性脑卒中[1-2]。认知功能障碍是学习记忆、言语、表达、理解、计算等能力的缺失。脑卒中后认知障碍发生率达47.3%[3]，严重影响脑卒中患者日常生活，阻碍患者全面康复。临床研究表明，针刺可改善患者的认知功能[4]。本课题组通过动物实验和临床试验研究均证明电针百会、神庭穴在改善认知障碍方面有一定作用[5-8]。

海马是调节学习记忆的关键部位，CA1区神经元对结构蛋白损害和能量障碍特别敏感；脑缺血缺氧或炎症等损伤易引起海马CA1区神经元损伤及突触丢失，导致记忆障碍，特别是空间记忆受损[9-12]。

嘌呤受体与海马密切相关[13-14]。嘌呤受体可分为P1和P2两大类，P2受体的配基是嘌呤核苷酸。P2受体又分为两类：离子通道P2X受体和G蛋白偶联P2Y受体。P2X7受体在海马神经元及神经胶质细胞均有表达[15]。研究表明[16-18]，脑卒中后，受损神经元和胶质细胞迅速释放ATP，激活胶质细胞P2X7受体；P2X7受体通过自身膜孔道结构或激活下游信号通路，促进炎症介质白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、肿瘤坏死因子-α (tumor necrosis factor-α,TNF-α)和IL-6产生和释放；炎症介质进一步上调P2X7受体表达，并增加其对细胞外ATP的敏感性，从而加速炎症反应，促进神经元死亡。侧脑室注射P2X7受体特异性抑制剂后，能有效保护海马区神经元，改善脑缺血再灌注大鼠空间记忆能力[19-20]。

本研究观察脑缺血再灌注大鼠学习记忆能力及海马CA1区P2X7受体表达，探讨电针治疗认知功能障碍的机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF清洁级雄性Sprague-Dawley大鼠42只，体质量230～260 g，购于上海斯莱克实验动物责任有限公司，生产许可证号SCXK(沪)2012-0002；由福建中医药大学实验动物中心饲养，许可证号SYXK(闽)2012-001。每笼5只，自由进食及饮水。

所有实验均遵照国际动物保护和使用指南的规定实施。

1.2 主要试剂和仪器

P2X7受体抗体(11144-1-AP)：美国PROTEINTECH公司。 大鼠IL-1β酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)试剂盒(F15810)、大鼠TNF-α ELISA试剂盒(F16960)：上海西唐生物科技有限公司。3600A线栓：广州佳灵生物技术有限公司。华佗牌G6805型电针仪：苏州医疗用品厂有限公司。Barnes迷宫：上海欣软信息科技有限公司。DMI4000B荧光倒置显微镜系统：德国LEICA公司。Motic Med 6.0数码医学图像分析系统、Image-lab图像分析系统：美国BIO-RAD LABORATORIES公司。

1.3 造模与分组

随机数字表法将大鼠分为假手术组(n=12)和手术组(n=30)。手术组参考Longa法[21]制备左侧大脑缺血再灌注动物模型。大鼠10%水合氯醛3 ml/kg腹腔注射麻醉，常规消毒颈部皮肤，颈正中切口，暴露左侧颈总动脉，向上分离并暴露左侧颈外动脉和颈内动脉；结扎颈总动脉和颈外动脉，用血管夹夹闭颈内动脉。在颈总动脉结扎处约3 mm处剪一小口，将线栓插入；撤去血管夹，缓慢推送线栓至大脑中动脉分支处，稍有阻力时停止，线栓距动脉分叉约18～20 mm；结扎颈内动脉固定线栓，清洗缝合创口。90 min后，缓慢抽出线栓，剪断体外多余线拴。

假手术组分离动脉，不予结扎和插线。

术中、术后注意保暖，置于25℃环境下苏醒。

动物苏醒后，按Longa评分判断模型是否成功。评分l～3分者入组实验。最终纳入24只大鼠，分为模型组、电针组各12只。

1.4 方法

造模成功后第2天，电针组采用自制捆绑法固定，参考《实验针灸学》[22]定位方法取百会、神庭。斜刺，深2 mm左右。接电针仪，疏密波，频率2/20 Hz，强度1～3 mA。每次30 min，每天1次，共7 d。假手术组和模型组同等条件抓取，不予任何治疗。

1.5 观察指标

1.5.1 神经行为学评分

造模后2 h和干预后1 d、3 d、7 d对各组大鼠行Longa评分。

1.5.2 Barnes迷宫测试

干预后3 d，采用Barnes迷宫测试大鼠空间记忆功能。迷宫由直径122 cm的圆形平台构成，四周分布20个洞口，洞口直径10 cm。逃避盒放在其中一个洞口的底部。检测前把大鼠置于逃避盒内30 s；风吹以及噪声等干扰刺激作为大鼠进入目标洞口的动机。实验时，大鼠置于圆形平台的中央起始盒内，电子跟踪设备记录其在300 s内找到正确洞口所用的时间(逃避潜伏期)和进入错误洞口的次数，共5 d。每次测试完毕后旋转圆形平台，并用70%酒精纱布擦拭清洗，以防通过嗅觉找到目标洞口。洞口位置保持不变。

1.5.3 免疫荧光检测

干预7 d后，各组取6只大鼠经腹腔静脉放血，前正中线剪开，心尖部及右心耳各剪开一个小口，用磨钝针头从心尖部插入心脏，进入颈动脉并固定，同时夹紧腹主动脉防止灌注液体进入下腔循环。用生理盐水300 ml快速冲洗，待流出血液呈较淡的粉红色停止。4%多聚甲醛缓慢灌注约400 ml，至大鼠前肢僵硬且轻微抽搐，头部坚硬停止。断头取脑，完整取出置4%多聚甲醛中常温固定，石蜡包埋，切片。

微波修复后，5%胎牛血清封闭，37℃孵育90 min。滴加P2X7受体一抗(1∶50)，4℃冰箱孵育过夜；次日用PBS冲洗3次，每次5 min。滴加荧光二抗，37℃避光孵育90 min，PBS清洗3次，每次5 min。抗荧光淬灭处理及封片(含DAPI)，风干后，立即用荧光倒置显微镜100倍下观察，Motic Med 6.0数码医学图像分析系统分析，记录平均光密度(optical density,OD)。

1.5.4 ELISA

干预7 d后，各组另6只大鼠腹主动脉放血，只灌注生理盐水，其他过程同上。冰上迅速取出大脑组织并用生理盐水冲洗干净，分离出左侧大脑海马CA1区，置于EP管内，迅速投入液氮罐中；保存于-80℃冰箱。

将海马CA1区组织称质量，加入10μl/mg蛋白酶抑制剂，充分研磨，4℃下3000 r/min离心20 min，取上清。按试剂盒说明书操作，酶标仪计算IL-1β、TNF-α含量。

1.6 统计学分析

采用SPSS 20.0软件进行统计分析。数据用(xˉ±s)表示。神经功能缺损评分不符合正态分布，采用非参数检验独立样本成对比较。逃避潜伏期、进入错误洞口次数、嘌呤受体P2X7平均OD值、IL-1β和TNF-α的含量均符合正态分布，采用单因素方差分析，两两比较，方差齐者用LSD法，方差不齐用Games Howell法。显著性水平α=0.05。

2 结果

2.1 神经行为学评分

假手术组无神经功能缺损；干预前，模型组和电针组间神经行为学评分无显著性差异(P＞0.05)；模型组和电针组Longa评分逐渐下降；干预后7 d，电针组较模型组降低(P＜0.05)。见表1。

表1 各组Longa评分比较

2.2 Barnes迷宫测试

干预7 d后，与假手术组相比，模型组逃避潜伏期显著延长(P＜0.001)，进入错误洞口次数显著增多(P＜0.001)；与模型组相比，电针组逃避潜伏期显著缩短(P＜0.001)，进入错误洞口次数显著减少(P＜0.001)。见表2。与假手术组相比，模型组大鼠轨迹分散于四周，杂乱；与模型组相比，电针组大鼠轨迹较集中，能较迅速找到目标洞口。见图1。

2.3 IL-1β、TNF-α表达

与假手术组相比，模型组大鼠IL-1β、TNF-α水平明显升高(P＜0.01)；与模型组相比，电针组IL-1β、TNF-α降低(P＜0.05)。见表3。

表2 各组Barnes迷宫测试结果比较

2.4 P2X7受体表达

假手术组P2X7受体平均光密度值显著低于模型组(P＜0.001)；与模型组相比，电针组P2X7受体表达明显减少(P＜0.01)。见表3。模型组P2X7受体表达散乱，电针组表达较规整。见图2。

表3 各组大鼠海马CA1区P2X7受体、IL-1β和TNF-α表达

图1 干预7 d各组寻找目标洞口轨迹图

图2 干预7 d各组海马CA1区嘌呤受体P2X7表达(免疫荧光染色，100×)

3 讨论

脑卒中后认知功能障碍主要表现为记忆力减退、执行功能障碍、注意力障碍、判断力和抽象思维损害。督脉联络脑及脏腑，总督一身阳脉之气，与神志密切相关。督脉调畅，脑髓得以濡养，神机灵透，肢体活动自如；若督脉亏虚，髓海失充，则神明失用。百会为“三阳五会”，位居巅顶；头为诸阳之会，百脉之宗，百会穴则为各经脉气会聚之处。神庭是督脉、阳明经、足太阳交汇之穴，为神志所在，其功在神。针刺督脉穴位百会、神庭有醒脑开窍、安神定志、增强记忆之功。

针刺可以改善脑缺血再灌注大鼠的神经功能缺损症状。李梦瑶等[23]发现，电针能让局灶性脑缺血再灌注大鼠血中内源性内皮祖细胞含量增加，并能促进神经功能恢复。皮敏等[24]研究表明，电针督脉穴位能改善脑缺血再灌注大鼠的神经功能。梁超等[25]发现，不同变频组合电针头穴预处理能减轻脑缺血后大鼠神经功能损伤。本研究显示，电针百会、神庭穴能够有效缓解脑缺血再灌注大鼠的神经功能缺损症状。

针刺也能改善大鼠的认知功能障碍。蔡丽等[26]针刺百会、四神聪等穴，针刺组记忆功能显著提高。陈彬等[27]发现，针刺能改善大鼠学习记忆功能。

Barnes迷宫对动物应激性刺激较小，不需要食物剥夺和足底电击，既不需要像放射臂迷宫那样禁食，也不需要像水迷宫那样强应激，且能排除Morris水迷宫等测试中大鼠肢体运动功能障碍对实验的影响，有较高认可度。本研究显示，电针可以降低脑缺血再灌注大鼠逃避潜伏期，减少其进入错误洞口次数，改善大鼠学习记忆能力。

细胞外ATP激活P2X7受体促进IL-1β产生和释放，是一条公认的炎症相关通路。有研究表明[28]，针刺对嘌呤受体有一定调控作用。电针治疗可下调脊髓嘌呤受体表达，减轻结肠免疫反应，减轻内脏痛觉敏感性[29-30]。Burnstock[28]发现，在中脑水管周围灰质区，电针对脊椎的镇痛效应与嘌呤受体活化密切相关；在脊髓背根神经元中，电针通过调控嘌呤受体，提高慢性神经性疼痛大鼠的痛阈。本研究表明，电针百会、神庭穴可有效抑制脑缺血再灌注大鼠P2X7受体表达。

本课题组前期研究表明，电针可能通过调控Toll样受体-4、核转录因子-κB信号通路，抑制缺血周围皮质区小胶质细胞的活化及炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6释放[5,31-32]。有研究显示[33-34]，针刺百会、大椎7 d，也能有效抑制治疗脑缺血再灌注大鼠缺血皮质半暗带TNF-α表达，改善神经功能障碍。本研究发现，电针百会、神庭穴可有效抑制脑缺血再灌注大鼠炎性因子IL-1β、TNF-α表达。

综上所述，电针百会、神庭穴能够改善脑缺血再灌注大鼠的空间学习记忆能力，其机制可能与抑制嘌呤受体P2X7表达，降低炎性因子IL-1β、TNF-α水平，改善海马CA1区神经炎症反应有关。

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