PD-1基因多态性与EOC易感性及预后的关系

， ，，

(山东省日照市中医医院妇科，山东 日照 276800)

卵巢癌具有易扩散浸润、早期无临床症状等特点，因此需要早诊断、早治疗。有研究发现卵巢癌中有绝大多数患者病理类型为卵巢上皮癌(epithelial ovarian cancer，EOC)[1]。目卵巢癌具有免疫原性已被越来越多的实验证明。近年发现与免疫逃逸有关的热点基因程序性细胞凋亡蛋白1(programmed apoptosis protein 1，PD-1)在肿瘤免疫逃逸中起到了重要作用。PD-1是一种分子量为50左右的Ⅰ型跨膜蛋白，可以与其配体程序性死亡受体-配体1结合后，显著抑制机体内T淋巴细胞的活性，进一步抑制身体内的免疫应答，从而协助肿瘤细胞，尤其是恶性肿瘤细胞出现“免疫逃逸”。PD-1基因多态性可造成不同个体间PD-1基因表达差异，进而影响蛋白表达，导致疾病的发生和发展。目前国内张会兰[2]对PD-1基因多态性与EOC的关系进行了相关报道，但是不同地区、不同环境下PD-1基因多态性与EOC关系有待进一步研究。本研究旨在探讨PD-1.1和PD-1.5单核苷酸多态(SNPs)与EOC患者发病风险及3年预后的关系。

1资料与方法

1.1一般临床资料

选取2009年4月至2012年5月就诊于山东省日照市中医医院的116例卵巢上皮癌患者，术中行快速冰冻切片，最终术后病理确诊为EOC的女性为本次研究卵巢癌组(Case组)。患者的年龄为23～73岁，平均年龄为(54.36±6.83)岁。其中确诊时年龄<50岁者42例(36.2%)，≥50岁者74例(63.8%)。根据国际妇产科联盟(FIGO)的相关标准，对EOC患者行临床分期，其中Ⅰ～Ⅱ期患者有33例(28.4%)，Ⅲ～Ⅳ期患者83例(71.6%)；分化程度：高分化卵巢癌8例(6.9%)，中分化79例(68.1%)，低分化29例(25.0%)。116例患者中无失访病例，所有患者均随访至截止时间或者死亡。疾病复发指标为无疾病进展生存时间(progressives free survival，PFS)，即手术切除病灶后复查时出现卵巢癌肿瘤标记物(CA125)升高、影像学检查异常、腹水等复发指征；评价生存预后的指标为总生存时间(over-all survival，OS)，时间跨度为从手术切除病灶后至死亡或者随访截止时间。

另收集同期来本院体检正常的110例女性为健康对照组(Control组)，其年龄在27～81岁，平均年龄(53.91±7.16)岁，其中年龄<50岁人员有38例(34.5%)，≥50岁人员72例(65.5%)。Control组需排除卵巢出现病变患者，包含有健康体检者及输卵管积液、子宫脱垂等患者。

Case组和Control组的所有对象均在完全自愿的基础上参与本研究，并签订知情同意书。两组的平均年龄比较差异无统计学意义(P>0.05)。

1.2获取DNA样本

研究人员用含有EDTA+枸橼酸钠(0.85mL)的采血管在无菌操作下采取两组受试对象的外周血5mL，轻轻摇匀，并且置于-4℃冰箱保存备用，用基因组DNA快速提纯试剂盒(美国Promega生物试剂公司)提取DNA，保存于-40℃冰箱中备用。

1.3 PD-1基因SNP分型测序

实验中使用的引物由上海英骏生物科技有限公司设计提供，PD-1.1上游引物：GCCATCCACAAGGTGGAAGCT，下游引物：CTCAACCCCACTCCCATTCTG。PD-1.5上游引物：CACCCTGCCTGCTTCTCCTG，下游引物：GAGCAGA￣CGGAGTATGCCACC。

采用RT-PCR法对所有受试对象行PD-1基因多态位点的基因型检测。PCR产物扩增反应所采用的实验条件为：95℃预变性1min，紧接94℃变性30s，而后64℃退火15s，进而72℃延伸25s，共计行35个循环后，最终在72℃下延伸2.5min。将所得到的PCR产物2μL及1μL引物序列，与10μL上样buffer(已混入Mark)混合，置于总体系为25μL，在含有2%琼脂糖凝胶上电泳，经95℃变性3min，并立即在冰水浴，获得终产物。根据ABI3100型测序分析仪对全部基因型进行测序。检测每个基因位点的准确性时，需要随机选取10%的PCR产物进行测序判断。具体电泳凝胶图见图1和图2。

注：通道1、4为AA基因；通道2为GG基因；通道3为AG基因。

图1 PD-1.1基因位点电泳图

Fig.1 Electrophorogram of different PD-1.1 genotypes

注：通道1、4为CC基因；通道2、3、5为CT基因；通道6为TT基因。

图2 PD-1.5基因位点电泳图

Fig.2 Electrophorogram of different PD-1.5 genotypes

1.4统计学方法

采用SPSS 17.0软件分析实验数据。采用Hardy-Weinberg平衡检验对两种PD-1基因分型及等位基因频率分布进行检验，采用行×列表的χ2检验卵巢上皮癌患者与健康者的等位基因和基因型频率分布，采用非条件Logistic回归分析PD-1.1、PD-1.5基因多态性与卵巢上皮癌发病的关系。采用Kaplan-Meier法分析PD-1基因中不同基因分型患者3年的生存情况，并采用Log-rank检验基因分型及等位基因之间的差异，采用Cox风险比例模型分析患者预后生存的相关基因分型及等位基因。以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1两组的一般临床资料

研究结果显示，Control组在平均年龄、初潮年龄、孕次及产次与Case组比较差异均无统计学意义(均P>0.05)，见表1。

表1 两组的一般临床资料比较结果[χ±S，n(%)]

2.2 PD-1.1和PD-1.5在不同组别中的分布

Case组PD-1.1基因型分布及等位基因频率与Control组比较差异均有统计学意义(均P<0.05)；Case组PD-1.5基因型分布与Control组比较差异无统计学意义(P>0.05)，而等位基因频率之间两组差异存在统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 PD-1.1和PD-1.5基因型及等位基因在不同组别中的分布比较结果[n(%)]

注：Reference表示参考。

2.3卵巢上皮癌患者临床相关因素与基因型的关系

PD-1.1基因分型与EOC患者临床分期和肿瘤分化程度有关系(均P<0.05)；PD-1.5基因分型与EOC患者年龄、临床分期、分化程度和病理类型均无关联(均P>0.05)，见表3。

表3 EOC患者临床相关因素与基因型的关系n(%)

Table 3 Correlation of clinical factors of EOC patients and genotypesn(%)

表3 EOC患者临床相关因素与基因型的关系n(%)

变量 PD⁃1．1 AAAGGGχ2P PD⁃1．5 CCCTTTχ2P年龄(岁)1．8940．3710．2460．884 <5010(23．81)23(54．76)9(21．43)24(57．14)16(38．10)2(4．76) ≥5027(34．49)34(45．94)13(17．57)43(58．11)26(35．13)5(6．74)临床分期7．7440．0211．0980．179 Ⅰ～Ⅱ6(18．18)16(48．49)11(33．33)20(60．61)11(33．33)2(6．06) Ⅲ～Ⅳ31(37．35)41(49．40)11(13．25)47(56．63)31(37．35)5(6．02)分化程度10．2290．0062．8910．082 高中分化22(25．29)50(57．47)15(17．24)51(58．62)30(34．48)6(6．90) 低分化15(51．72)7(24．14)7(24．14)16(55．17)12(41．38)1(3．45)病理类型2．6230．1182．9360．076 浆液性19(32．76)28(48．28)11(18．96)34(58．62)20(34．48)4(6．90) 黏液性6(35．29)8(47．06)3(17．65)9(52．94)7(41．18)1(5．88) 子宫内膜样12(36．59)21(51．22)8(12．19)24(58．54)15(36．58)2(4．88)

2.4基因多态性与术后3年和5年复发率的关系

PD-1.1基因AA型、AG型及GG型3年和5年复发率分别为70.27%、68.42%、36.36%和86.49%、80.70%、63.64%，三种基因型3年和5年的复发率差异均有统计学意义(均P<0.05)；PD-1.5基因CC型、CT+TT型3年和5年的复发率分别为62.69%、63.27%和80.60%、77.55%，各基因分型在3年和5年的复发率差异均无统计学意义(均P>0.05)，见表4。

表4 基因多态性与术后3年和5年复发率的关系 n(%)

Table 4 Relationship between gene polymorphism and 3-year and 5-year recurrence raten(%)

表4 基因多态性与术后3年和5年复发率的关系 n(%)

基因型 3年复发率 是(n=73)否(n=43)χ2PHRa(95%CI) 5年复发率 是(n=92)否(n=24)χ2PHRa(95%CI)PD⁃1．1 AA26(70．27)11(29．73)11．6340．003reference32(86．49)5(13．51)8．2180．015reference AG39(68．42)18(31．58)0．478(0．209～1．322)46(80．70)11(19．30)0．488(0．219～0．910) GG8(36．36)14(63．64)0．567(0．364～0．824)14(63．64)8(36．36)0．653(0．465～0．992)PD⁃1．5 CC42(62．69)25(37．31)0．0040．949reference54(80．60)1319．40)0．1600．689reference CT+TT31(63．27)18(36．73)1．210(0．553～2．645)38(77．55)11(22．45)1．202(0．487～2．969)

注：Reference表示参考，HRa表示危害比。

2.5基因多态性与术后3年和5年生存率的关系

PD-1.1基因AA型、AG型及GG型5年总生存率分别为18.92%、43.86%和54.55%，经Kaplan-Meier分析，其差异有统计学意义(P<0.05)；PD-1.5基因CC、CT+TT基因型患者5年总生存率分别为38.81%和36.73%，经Kaplan-Meier分析，其差异无统计学意义(P>0.05)，见表5、图3。

纠正Case组中患者的年龄、临床分期及初次手术后残存灶的大小，经Cox回归多因素分析结果显示，PD-1.1基因分型为卵巢上皮癌患者的5年复发率和死亡率的危险因素(HR=2.709，95%CI：1.127～4.892，P=0.004)。

表5基因多态性与术后3年和5年生存率的关系n(%)

Table 5 Relationship between gene polymorphism and postoperative 3-year and 5-year survival raten(%)

基因型 3年生存率 生存(n=59)死亡(n=57)χ2PHRa(95%CI) 5年生存率 生存(n=44)死亡(n=72)χ2PHRa(95%CI)PD⁃1．1AA17(45．95)20(54．05)4．2230．089reference7(18．92)30(81．08)9．1110．011reference AG27(47．37)30(52．63)0．531(0．124～0．822)25(43．86)32(56．14)0．628(0．234～0．983) GG15(63．64)7(36．36)0．467(0．264～0．724)12(54．55)10(45．45)0．573(0．365～0．916)PD⁃1．5V CC33(49．25)34(50．75)0．1640．685reference26(38．81)41(61．19)0．0520．820reference CT+TT26(53．06)23(46．94)1．165(0．557～2．435)18(36．73)31(63．27)1．092(0．510～2．337)

注：Reference表示参考，HRa表示危害比。

注：图A、B为PD-1.1基因，A为总生存率，B为疾病无进展生存率；图C、D为PD-1.5基因，C为总生存率，D为疾病无进展生存率。

图3 Kaplan-Meier法分析PD-1.1、PD-1.5不同基因位点5年内总生存、疾病无进展生存率

Fig.3 Analysis of 5-year overall survival rate and progression free survival rate of different gene loci in PD-1.1 and PD-1.5 by Kaplan-Meier method

3讨论

3.1 PD-1.1基因多态性与卵巢上皮癌发病的关系

PD-1作为CD28免疫球蛋白超家族中的一员，是近年来新发现的与恶性肿瘤细胞免疫逃逸有关的关键基因，其位于人染色体2q37.3上，能够编码某些跨膜糖蛋白，已经证实其在肿瘤免疫逃逸中起重要作用。以往国内外关于PD-1基因多态性与疾病关系的研究中发现PD-1.1多态性与不同疾病的发病风险关系不尽相同。有研究结果显示PD-1基因多态性与乳腺癌发病风险有关，并且GG型具有降低乳腺癌的发病风险，C等位基因具有增加乳腺癌发病风险[3]。一项国外研究显示，PD-1.1基因分型中的AA基因型人员发生类风湿性关节炎的可能性明显小于AG、GG型[4]，同时有研究认为PD-1.1多态性与乙型肝炎的发病风险有关[5]。目前对于PD-1.1基因多态性与卵巢癌，尤其是卵巢上皮癌的发病风险的关系研究报道较少。本研究与张会兰[2]的研究报道不尽一致，其研究显示PD-1.1、PD-1.5基因多态性与卵巢上皮癌的发病，尤其术后复发及生存率之间无明显相关性，但本研究中却发现，卵巢上皮癌患者中等位基因A和G频率分布与对照组人员有显著性差异。本研究结果显示G等位基因携带者患卵巢上皮癌的风险是A基因携带者的0.837倍。进一步对所有患者进行随访发现，携带AA基因型的卵巢上皮癌患者术后复发率显著高于AG或GG基因型，而生存率低于AG、GG型。因此认为导致本研究与张会兰研究结果不相一致的原因可能有：①入选的卵巢上皮癌患者存在地域、环境差异，环境及地域等对基因型的分布存在一定的差异；②张会兰的研究在随访时出现较多的失访，因此认为在一定程度上可能会导致误差。此外需要指出的是，本研究与其研究均证实，卵巢上皮癌患者AA型比例较AG、GG型有显著性差异，而本研究在随访过程中未出现失访患者。

3.2 PD-1.5基因多态性与卵巢上皮癌的关系

关于PD-1.5基因位点与疾病相关的研究，目前发现CT+TT基因型相比于CC基因型能使非小细胞肺癌患者发病风险增高，C等位基因与非小细胞肺癌发病风险有关[6-7]。有研究发现，胃腺癌及胃溃疡患者体内CT基因型频率显著高于正常人[8-10]。

总之，对PD-1基因多态性与疾病的关系研究较多，包括乳腺癌、黑色素瘤等[11-14]。需要指出的是，在本研究中未发现Case组和Control组的CC、CT+TT基因型及等位基因频率分布差异存在统计学意义。因此认为PD-1.5多态位点的C和T基因可能与卵巢上皮癌发病无关。

3.3小结

目前关于PD-1.1和PD-1.5多态性与恶性肿瘤临床预后关系的研究较少。本研究结果表明卵巢上皮癌患者3年、5年的术后复发率及生存率与PD-1.1基因型频率分布有关，而与PD-1.5无关。综合以上分析，本研究结果可用于预测女性卵巢上皮癌的发病风险，辅助临床对卵巢上皮癌的早期诊断，同时对患者的预后治疗提供参考依据。通过早期诊断女性PD-1.1基因型分布，可为预防卵巢上皮癌提供依据。

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