产维素酶菌株SB-4的理化特性及产酶条件优化

李昌珠，蒋丽娟，陈景震，张良波，易智彪，李培旺

纤维素是细胞壁中的重要成分，也是自然分布较广、数量较多的多糖类生物质资源［1-2］。纤维素在纤维素酶的作用下可降解为可溶性单糖或小分子糖等平台化合物，被广泛用于生物质能源、食品、医药等行业［3-4］。纤维素规模化生物转化及应用的首要条件是筛选出高产纤维素酶菌。在自然界中软体动物、原生动物、微生物（真菌、细菌、放线菌等）都具有合成、分泌纤维素酶的能力［5］。目前，纤维素酶生产主要是通过真菌（木霉、曲霉、青霉等）和细菌（纤维黏菌、纤维杆菌和芽孢杆菌等）等进行生物发酵。但不同生物合成的纤维素酶种类和降解能力存在明显不同［6］。真菌所产纤维素酶种类多为胞外酶，容易提取、纯化，但大多数真菌孢子易传播、感染，致病能力强。细菌所分泌的纤维素酶种类多，酶的协同效应显著，纤维素降解能力强，但分泌纤维素酶量少，且大多为胞内酶。放线菌是抗菌素和纤维素酶的主要生产菌，产生的纤维素酶活力高，同时，放线菌为单细胞，结构简单，便于遗传分析。放线菌发酵生产纤维素酶成为了国内外的研究热点。本文对在白蚁中分离获得的高产纤维素酶放线菌的理化特性及发酵条件进行研究，不仅可以产纤维素酶放线菌种，丰富放线菌纤维素酶系，还可以为放线菌规模化应用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 菌种 菌种来源于油料能源植物高效转化国家地方联合工程实验，为湖南省林业科学院从白蚁消化道分离获得，命名为 SB-4。

1.1.2 培养基

（1）明胶培养基（g/L）：蛋白胨 0.5 g，葡萄糖 2 g，明胶 20 g；

（2）无机盐纤维素水解培养基（g/L）：磷酸氢二钾 0.5 g，氯化钠 0.5 g，硝酸钾 1 g，七水硫酸镁 0.5 g，pH＝7.0～7.2；

（3）淀粉水解培养基：牛肉膏 5.0 g，蛋白胨 10.0 g，氯化钠 5.0 g，可溶性淀粉 2.00 g，pH＝7.2～7.4；

（4）牛奶凝固培养基：牛奶 100 ml，碳酸钙0.02 g，pH＝7.2～7.4；

（5）Tresner's 培养基（g/L）：蛋白胨 10 g，柠檬酸铁 0.5 g，磷酸氢二钾 1 g，琼脂 15-20 g，pH＝7.2；

（6）黑色素产生培养基（g/L）：酪氨酸（L-Tyr）1 g，酵母膏 1 g，氯化钠 8.5 g，琼脂15～20 g，水 1 000 ml，pH＝7.2；

（7）基础培养基：纤维素钠 10 g，蛋白胨 1 g，硫酸铵 0.5 g，磷酸二氢钾 1 g，氯化钾0.5 g，七水硫酸镁 0.2 g，二水硫酸钙 0.1 g，pH＝7.5；

（8）发酵培养基（g/L）：纤维素钠 10 g，硫酸铵 0.5 g，磷酸二氢钾 1 g，氯化钾 0.5 g，七水硫酸镁 0.2 g，二水硫酸钙 0.1 g，pH＝7.5。

1.2 实验方法

1.2.1 菌落形态和生长特征观测 将 2 μL 菌液涂布在 CMC2Na 培养基、葡萄糖-酵母膏培养基、高氏 1 号培养基、甘油天门冬素琼脂培养基、无机盐淀粉琼脂培养基、酵母麦芽糖培养基（ISP-2）进行培养，待菌落形成后观测单菌落形状、大小、颜色和突起等特征。

1.2.2 菌种理化特性检测

（1）革兰氏染色：将菌涂片固定，按常规革兰氏染色过程进行染色，观测鉴定。

（2）明胶液化试验：将 24 h 培养的幼龄菌穿刺接种灭菌后的明胶斜面培养基上，以两支未接种的斜面培养基为空白对照，于 20 ℃ 条件下分别培养 2 d，7 d，10 d，14 d 和 30 d，在 20 ℃ 室温下观察菌落生长状况和明胶是否液化。菌生长，明胶表面无凹痕仍保持为稳定的凝块，则为阴性；菌生长，在 20 ℃ 以下明胶凝块部分或全部变成可流动的液体，则为明胶水解阳性。

（3）纤维素水解观测：将长 5～7 cm，宽1～0.5 cm 的无菌滤纸条的 1/3 浸入接有本菌种无机盐培养基中，以不接菌为对照，置于 28 ℃ 恒温培养 10 d，观察培养结果。

（4）淀粉水解观测：将菌种接于淀粉培养基平板上，28 ℃ 培养 24 h，待菌落形成后滴少量碘液于平板中，观察有无透明圈的产生。菌落周围若出现无色透明圈，则说明淀粉已经被水解。

（5）牛奶凝固与液化测定：将菌种接种在脱脂牛奶中，28 ℃ 恒温培养，分别于第 3 d，第6 d，第 10 d，第 20 d，第 30 d 观察培养基的变化，若牛奶凝块，则为放线菌产生了凝乳酶，继续培养，如凝固现象消失，溶液呈半透明或透明状，则为菌种产生了蛋白酶，是蛋白水解为可溶性状态，称胨化。

（6）菌种产硫化氢测定：将菌种接种在tresner's 培养基上，28 ℃ 恒温培养 10 d 左右，若出现黑褐色沉淀，则表示产生硫化氢，为阳性。

（7）菌株产黑色素观测：将菌种接种于酪氨酸固体培养基上，28 ℃ 恒温培养，于第 1 d，第2 d，第 4 d 观察平板上黑色素产生状况。

1.2.3 发酵条件优化

（1）培养时间对菌体产酶的影响：从放线菌 SB-4 菌落上刮取孢子置于种子培养基中培养2 d，按 15% 的接种量将接入装有发酵培养基的500 mL 三角瓶中（装液 200 mL），28 ℃，200 r/min条件下振荡培养，每隔 24 h 取样检测发酵液酶活。

（2）通气量对发酵液酶活的影响：分别将50、100、150 和 200 mL 液体培养基装于 500 mL三角瓶进行摸拟不同的通气量，其他培养条件不变，比较不同通气量条件下菌体产酶的活性。

（3）发酵培养基中不同碳源对菌体产酶的影响：以甲基纤维素钠、乳糖、葡萄糖、麦芽糖、糊精、甘露醇和甘油为单一碳源，装液量为200 mL，其它培养发酵条件不变，培养 72 h 进行测发酵液酶活性。

（4）发酵培养基中不同氮源对菌体产酶的影响：以牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、尿素、硝酸铵、光皮树饼粕为单一氮源，装液量为 200 mL，其它培养发酵条件不变，培养 72 h 进行测发酵液酶活性。

1.2.4 纤维素酶活测定 内切葡聚糖酶（CMC）活力测定采用 CMC 糖化法测定［7］。滤纸酶（FPA）则定采用滤纸糖化法［8］。β-葡萄糖苷酶（Cx）活力测定采用分光光度法［9］。

1.2.5 数据分析 采用 Microsoft Excel 2010、SPSS 18.0 统计软件对试验数据进行分析。

2 结果与分析

2.1 菌株 SB-4 的菌丝、菌落形态及生长特性

菌株 SB-4 在不同的培养基中形成的菌落形态及生长特性存在明显的区别，结果见表 1。菌株 SB-4 在 CMC2Na 培养基上菌落生长良好（见图 1），单菌落，同心环，最初为白色，4 d 后逐渐变成浅灰色，气生菌丝分枝，孢子排列成节（见图 2），SB-4 菌株在无机盐淀粉琼脂培养基上基本不生长。根据阎逊初编著《放线菌的分类和鉴定》［10］，初步断定为放线菌节杆菌属。

图 1 SB-4 在 CMC2Na 培养基中菌落特性Fig.1Colony characteristic of SB-4 strain on CMC2Na medium

图 2 菌丝及孢子显微形态结构Fig.2 Microscopic structure of mycelium and spore

2.2 菌株 SB-4 生理生化特性

表 2 所示为菌株 SB-4 的生理生化特性的鉴定结果，其中革兰氏染色、纤维素水解试验、淀粉水解试验、牛奶凝固与液化试验、产硫化氢测定试验、黑色素产生试验均呈阳性，而明胶液化试验呈阴性。

表1 SB－4 在不同培养基上生长的菌落特征Tab.1 Colony characteristics of strain SB-4on different medium

表2 SB－4 的生理生化试验结果Tab.2 Physiological and biochemical properties of strain SB-4

2.3 SB-4 发酵条件优化

2.3.1 不同发酵时间对 SB-4 酶活的影响 不同发酵时间对纤维素酶 CMC、FPA、Cx 酶活性的影响见图 3。由图可知，三种纤维素酶活性在发酵的第 12～24 h 出现快速增加，第 24～72 h 则进入平缓增加期，到第 72 小时达到最大值，分别为随后出现缓慢下降。这与菌体的生长曲线和酶的产量具有一定的相关性。考虑能耗和酶活性之间的关系，该菌株最佳的培养时间是 72 h，此时对纤维素酶 CMC、FPA、Cx 酶活性分别为 39.94 U/mL、28.13 U/mL 和 21.89 U/mL.

图3 培养时间对菌株SB-4酶活的影响Fig.3Effect of culture time on enzyme activity of strain SB-4

2.3.2 通气量对 SB-4 酶活的影响 通过不同装液量模拟通气量，不同通气量对 SB-4 酶活性的影响见图 4。由图可知，通气量对纤维素酶 CMC、FPA、Cx 酶活性的影响趋势一致，但均不是显著，也说明在 50～250 m 装液量对菌体产酶影响不大。纤维素酶 CMC、FPA、Cx 酶活性在装液量为 200 ml 时为最高，分别为 39.94 U/mL、28.13 U/mL 和 21.89 U/mL。综合考虑，最佳的通气量为300 mL，即 500 ml 三角瓶中装入 200 mL 发酵液。

图4 装液量对菌株SB-4酶活的影响Fig.4Effect of medium volume on enzyme activity of strain SB-4

2.3.3 不同氮源对 SB-4 酶活性的影响 以牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、尿素、硝酸铵、光皮树饼粕为单一氮源，不同氮源培养对 SB-4 酶活性的影响见图 5。由图可知，有机氮源对 SB-4 纤维素酶 CMC、FPA、Cx 酶活性比无机氮源高，其中以酵母膏为单一氮源的酶活性最高，光皮树饼粕次之，尿素最小。酵母膏为最佳氮源，以其为单一氮源发酵时纤维素酶 CMC、FPA 和 Cx 酶活性分别为 47.09 U/ml、41.81 U/mL 和 28.62 U/mL。

2.3.4 不同碳源对 SB-4 酶活性的影响 甲基纤维素钠、乳糖、葡萄糖、麦芽糖、糊精、甘露醇和甘油为单一碳源，不同碳源培养对 SB-4 酶活性的影响见图 6。由图可知，不同碳源对 SB-4 纤维素酶 CMC、FPA、Cx 酶活性影响显著，其中以羧甲基纤维素钠为碳源的酶活力最高，其次是乳糖、葡萄糖、麦芽糖、糊精、甘露醇，甘油最小。羧甲基纤维素钠为最佳碳源，以其为单一碳源发酵时，纤维素酶 CMC、FPA 和 Cx 酶活性分别为 48.68 U/ml、39.69 U/mL 和 39.42 U/mL。

图5 氮源对菌株SB-4酶活性的影响Fig.5 Effect of nitrogen sources on enzyme activity of strain SB-4

图6 碳源对菌株SB-4酶活性的影响Fig.6 Effect of carbon sources on enzyme activity of strain SB-4

3 结论与讨论

高等白蚁生境多样，饮食结构丰富，以富含木质素、纤维素的木材、枯草等为食源［11-12］。白蚁的肠道内共生有大量的细菌、真菌、放线菌等微生物［13］，可筛选出多种高产纤维素酶菌株。本试验利用羧甲基纤维素钠培养法、革兰氏染色法、牛奶凝固与液化法、产硫化氢生产、黑色素产生和纤维素酶活性测定法对产纤维素酶 SB-4 菌株进行鉴定，结合菌落形态观察和菌丝及孢子显微镜观察,初步断定为放线菌节杆菌属。

微生物发酵是个非常复杂的过程，其生产工艺受众多因素影响，如培养基、培养时间、通气量、氮源、碳源等［13］。培养条件的优劣直接影响微生物发酵效率及产酶能力。因而，微生物发酵条件优化极其重要。本试验对筛选出的放线菌 SB-4 在发酵时间、通气量、氮源和碳源等产酶条件上进行优化。最优条件是以酵母膏为氮源，以羧甲基纤维素钠碳源，通气量为 300 mL，即在 500 ml 三角瓶中装入 200 mL 发酵液，发酵 72 h，SB-4 菌株的纤维素酶 CMC、FPA 和 Cx 酶活性分别为 47.09 U/ml、41.81 U/mL 和 28.62 U/mL。

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