基因治疗核酸递送载体的研究进展

杨　姣,孙　甫

(西安医学院第一附属医院骨科,西安　710077;*通讯作者,E-mail:sunfu20019@163.com)

基因治疗在进行癌症、传染性疾病、遗传性疾病和心血管疾病治疗方面是一种有效手段,具有极为广阔的应用前景。然而,由于DNA和siRNA作为核酸类生物活性大分子,体内极易被降解,直接通过口服或静脉注射给药,生物利用度极低,因此需要载体的递送。核酸递送系统,即一种能够有效包裹和传递外源性遗传物质进入特定细胞的高效、低毒的载体系统。目前常用的基因治疗载体主要有两大类:病毒和非病毒载体。病毒载体有着感染细胞的天性,有一整套将自己的基因导入靶细胞的步骤,转运效率高,然而制备与生产困难、细胞毒性、免疫原性以及包装外源基因的大小限制是病毒载体应用面对的主要障碍,虽已用于临床,但安全问题凸显。非病毒类载体是一些在生理条件下带正电荷的化合物,包括阳离子多聚物,阳离子脂质体等。它们通过电荷相互作用原理,与阴性负荷的核酸相互作用并通过内吞作用进入到细胞内。它不需要面对病毒类载体的种种不利,制备简便,没有免疫原性。但是它们导入外源基因的效率远低于病毒类载体。因此构建安全、有效、可控的载体是目前基因治疗研究的关注热点。本文就目前核酸递送载体种类、各自的优缺点做一综述,为新型核酸递送载体研究提供方向,并对RTN新型纳米分子递送材料加以介绍。

1　病毒载体

病毒载体是分子生物学研究中的一种常用工具,可将遗传物质带入细胞。目前可用做载体的病毒主要有逆转录病毒、慢病毒、痘病毒、痘苗病毒、风疹病毒及腺病毒等。经过基因工程改造的腺病毒(adenovirus)和腺病毒相关病毒(adenovirus-associated virus,AAV)是两种常见的病毒载体,它们适用的宿主范围较广,可通过基因重组获得靶向性,不受靶细胞是否为分裂细胞所限[1]。腺病毒基因组为双链DNA,可插入相对较大的外源基因片段,不会整合到宿主基因组中,可以瞬时表达;而腺病毒相关病毒则是一种单链DNA病毒,可将外源DNA整合到宿主基因组的特定位点。目前,这些经过重组的病毒载体已被用于肿瘤疾病的基因治疗当中[2,3]。

以腺相关病毒(AAV)为载体的心脏基因治疗正在成为治疗甚至治愈目前难以治愈的心脏疾病的全新平台。有实验研究表明[4],以AAV为载体的心力衰竭基因治疗的动物模型已取得了重大进展,这种基因治疗方式有可能改变现有心脏疾病的治疗方法。

Duchenne肌营养不良(DMD)是由肌营养不良蛋白基因突变引起的不可治愈的X连锁肌肉消瘦疾病。在临床基因治疗研究中,使用高功能微营养不良蛋白基因和重组腺相关病毒(rAAV)载体的基因治疗是治疗DMD极有吸引力的策略。研究表明[5]DMD大型动物模型中系统性rAAV-cMD1传递具有很高的安全性和有效性。

新生血管性年龄相关性黄斑变性(nAMD)中,长期表达抗血管内皮生长因子(VEGF)蛋白的基因治疗可以改善慢性玻璃体内治疗的临床治疗负担。已有研究表明[6],腺相关病毒(AAV)载体可以转导视网膜色素上皮细胞,通过AAV2递送的色素上皮衍生因子基因在晚期nAMD中的Ⅰ期试验已得到早期应用。

虽然病毒载体作为高效的基因递送系统得到了广泛应用,其转染及表达效率高,是目前在体内高效表达外源基因最有效的工具之一。但病毒载体仍存在不可避免的问题:病毒载体自身具有免疫原性及潜在的突变风险,在安全性上有很大隐患,而且病毒载体缺乏靶向性,对插入DNA长度也有限制。所以逐渐出现各种非病毒载体成为基因递送载体的主流。

2　非病毒载体

2.1　阳离子脂质体

阳离子脂质体用于核酸的转染已有数十年历史,是目前研究中最有效、细胞毒性最小的非病毒基因传递载体之一[7,8]。常见的有Dc-Chol/DOPE、普通阳离子脂质双层、脂质体DOTAP、Lipofectine、pH敏感脂质体等。

2.1.1递送方式在生理pH值下,带正电的阳性脂类的头部基团,通过与带负电的核酸的磷酸基团相互作用,形成多个脂质体颗粒包裹核酸分子的夹层结构。仍带有一定的正电荷复合物通过电荷间相互作用被细胞内吞或与细胞膜融合。在内吞体环境中,阳离子脂质体中的中性脂类发生构象改变,导致复合物被释放到胞质中,从而避免了核酸遭到溶酶体的破坏[9]。在胞质中释放出来的核酸在一定的时间解开与阳离子脂质体的结合,并在有丝分裂时进入核内,表达其携带的基因。

2.1.2研究进展Schiedner等[10]在1991年将一系列胆固醇衍生物的阳性脂类用于核酸转染,其中DC-Chol以其高效率、低毒性而更具应用价值。随后,DC-Chol与中性脂类DOPE联合的阳离子脂质体被成功地应用于一系列包括实验动物和人在内的基因递送实验[11,12]。

谢培英等[13]在2002年发现硫代反义寡聚核苷酸及其脂质体在细胞水平有抗病毒作用,影响单疱病毒性角膜炎的发病,用于防治单疱病毒性角膜炎。其研究结果表明,脂质体包裹可提高寡聚核苷酸的细胞通透性,因DNA带负电,而组织细胞也带负电,因此用正电荷脂质体包裹寡聚核苷酸可提高其穿透细胞的能力。

于丹丹等[14]在2011年制备了SurⅥⅥnT34A基因质粒/脂质体复合物,用C57小鼠建立了Lewis皮下移植瘤动物模型,分别做了几组对照试验,研究发现SurⅥⅥnT34A质粒/脂质体复合物对Lewis肺癌治疗有效,并且可以对较小剂量顺铂化疗起到显著增效作用,联合治疗能够进一步诱导肿瘤细胞凋亡,抑制肿瘤微血管生成,从而控制肿瘤生长。

2011年中南大学湘雅二医院开拓了脂质体介导鼠CD40L基因联合IL-12治疗鼠肝细胞癌的研究,结果显示脂质体介导鼠CD40L基因联合IL-12治疗鼠肝细胞癌,能使癌细胞的凋亡增加,发挥抗肿瘤效应,通过CD8+T细胞的介导、血清IL-12水平的增加和增强NK细胞的凋亡,抑制肿瘤的生长,延长荷瘤小鼠存活期[15]。

2.1.3存在问题阳离子脂质体的低细胞毒性,结构多样性,可控的水溶性和脂溶性,适当的密度和正电荷分布,高转移效率和潜在的靶向功能都使之成为新型非病毒载体基因递送的有效方法之一。在现有四种L-阿拉伯糖基阳离子糖脂(Ara-DiC12MA,Ara-DiC14MA,Ara-DiC16MA和Ara-DiC18MA)中,Ara-DiC16MA脂质体在HEK293,PC-3和Mat细胞中具有良好的转染效能,并且在体外也保持低细胞毒性和更好的摄取能力,这表明Ara-DiC16MA将会成为低毒基因递送的有效载体[16]。但是,无论脂质体与质粒的复合物,还是脂质体自身,在通过内吞途径进入胞质后,只有很少一部分核酸能够进入核内。因为体积太大不可能通过核孔复合体的途径入核,所以都要依赖有丝分裂时核膜的暂时消失才能进入。因而,脂质体如何有效进入细胞核,成为其核酸递送的主要问题。

2.2　阳离子多聚复合物

目前运用较为广泛的阳离子多聚复合物有聚乙烯亚胺PEI、聚赖氨酸PLL、聚4-羟基-L-脯氨酸酯、PEI/PLA复合物介导的转染等。其中PEI是近年来被应用于基因载体研究的新型阳离子多聚物,在许多基因治疗研究中表现出优异的转染能力,研究发现PEI的聚阳离子结构非常适合包装核酸。PEI的每3个单体有一个质子化的氨基氮原子,呈多聚体的PEI被称为“质子海绵”[17]。这些特性使得PEI能有效地保护核酸抵抗内吞体酸性环境的降解作用。另外,一些实验还表明PEI具有一定的使内吞体膜去稳定的能力[18]。在PEI/PLA复合物中,PLA可能起到一种促融多肽的作用,即帮助复合物尽快从内吞体释放到胞质中,减少其被溶酶体环境破坏。

在癌症的基因治疗中,阳离子聚合物作为递送载体将siRNA在体内有效递送到靶细胞的研究和应用已有许多报道,2016年文献报道,研究使用胶原蛋白水凝胶作为载体,以测试Id1靶向siRNA局部和持续递送体内胃癌抑制的可行性,为了增强siRNA的递送,PEI被用于斑块修饰,结果表明,加入PEI的胶原蛋白水凝胶载体可促进Id1-siRNA进入靶细胞,延长沉默效应,进一步抑制体外和体内的肿瘤生长[19]。

HIV-1感染的宿主自噬蛋白Beclin1的活化是控制小胶质细胞中HIV复制和病毒诱导的炎症反应的重要机制。2017年Rodriguez等[20]在成年小鼠脑中利用PEI作为基因载体的siRNA对Beclin1基因的非侵入性鼻内递送的生物分布和功效进行研究。靶向Beclin1的siRNA的鼻内递送明显地耗尽了脑组织中的靶蛋白表达水平,没有毒性证据,且通过拉曼光谱证实了siRNA与PEI聚合物的结合。这些结果表明,鼻内药物递送允许将PEI-siRNA直接递送到中枢神经系统,这为HIV感染的脑中沉默基因介导的治疗提供了有效手段。

2016年Wang等[21]用中性酰肼基团取代PEI的伯氨基,产生新类型中性聚合物,这种聚合物不仅在体外显示出良好的生物相容性和细胞内化效率,而且还允许斑马鱼心脏的组织摄取。他们的实验结果显示,将常规支链PEI转化为这种新类型的非病毒载体中性聚合物,可使其递送siRNA分子更中和、稳定、高效,并且所得到的功能递送系统可进一步探索用于治疗心血管疾病的siRNA治疗的开发。

阳离子多聚复合物具备良好核酸递送载体的潜能,但是其本身存在的细胞毒性也不容忽视,目前,对于阳离子多聚物介导的转染确切的细胞内过程研究还处于起步阶段。有效地降低其细胞毒性是目前研究的主要问题。

2.3　多肽蛋白类递送载体

多肽用作递送载体,既可以用作药物载体的修饰剂,也可以作为载体的主要成分。利用多肽修饰的阳离子聚合物,能提高核酸分子的组织靶向性、细胞透膜率以及生物活性。作为载体,其与药物之间以共价键形式相连,结合后稳定性高,且在体内可降解,无毒,具有良好的生物相容性。

2017年Wan等[22]将多功能肽与脂质结合形成复合物,即脂质1,2-二油酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DOPE)与明确定义的合成多功能肽结合,这种递送系统的产生和优化为乳腺癌细胞开发了有效的基因传递平台。其研究结果表明,肽/脂质杂交系统是将DNA或siRNA递送到乳腺癌细胞中的优选候选物,其可用于靶向治疗Bcl-2过度表达的乳腺癌。

多肽介导的核酸药物递送系统能显著提高药物的透膜性和靶向性,减少其毒副作用,增强疗效,在药物靶向递送系统中也具有广阔的应用前景。不过,肽类载体的制备工艺、脱靶效应及毒副作用是其在核酸药物递送系统应用研究领域中需解决的问题。

2.4　研究广泛的其他递送载体

2.4.1环糊精类聚合物其属于糖性聚合物,生物相容性很好,但环糊精载体在体内的应用受高盐浓度下不稳定、易聚集的限制。环糊精衍生物可以直接作为基因递送载体,也可作为连接臂或是修饰物用于其他基因递送载体的构建,还可通过准聚轮烷或聚轮烷的形式用于基因递送。研究表明,含转铁蛋白的环糊精类聚合物与siRNA形成的复合物在小鼠体内可以抑制转移性尤文氏肉瘤的生长[23]。

2016年Jiang等[24]研究发现了基于聚β-环糊精(PCD)和偶氮苯末端聚阳离子的超分子宿主—聚阳离子基因递送系统。Jiang等[24]通过体外实验表明,光敏超分子多阳离子聚合物(PCD/Az-LPDM/DNA和PCD/Az-BPDM/DNA)具有更高的转染效率和更低的细胞毒性,同时在UV照射之后,更多的DNA在细胞核内部传递和释放,所以光敏超分子复合物的转染效率明显提高。因此,含有偶氮苯封端的阳离子聚合物和PCD的光响应超分子宿主-客体系统是有希望的基因载体。

2015年Li等[25]开发了具有pH敏感性的八精氨酸修饰的葡聚糖基因载体。α-环糊精用八精氨酸(CDR)修饰后具有优异的细胞穿透能力,他们选择葡聚糖作为骨架,实验研究表明,用脱壳多糖的基于CPP的复合物可能成为有前景的非病毒基因递送载体。

虽然环糊精在基因递送领域具有极为广阔的应用前景,但仍存在体循环稀释稳定性差、内涵体逃逸能力弱和转染效率低等问题。

2.4.2细胞穿膜肽(cell-penetrating peptides,CPP)细胞穿膜肽是一类能携带大分子物质进入细胞的短肽,其本身具有主动穿过细胞膜屏障的能力且这种穿膜能力不依赖经典的胞吞作用。近年来,已经被用于药物胞内递送的载体,可以将DNA、siRNA、小分子药物、蛋白和胶束等治疗物质有效递送至细胞内发挥治疗作用。

2016年Fan等[26]在研究碘化钠转运蛋白(NIS)的细胞穿膜肽对甲状腺癌I-131放疗影响时,他们结合HIV-1 TAT肽(细胞穿透肽,dTAT),并建立了纳米颗粒载体(dTAT NP),将dTAT NP转染培养的TPC-1细胞作为模型来研究这种针对肿瘤靶向基因递送的细胞穿透策略的传递效率。

然而,由于CPP作为递送载体的应用复杂且难于控制,其摄取效率、生物利用度及毒性等方面的问题都有待于进一步研究。

2.4.3壳聚糖壳聚糖是新研发的第2代非病毒载体,由阳离子聚合物、阳离子脂质体以及核酸组成。脂质体/聚合物/pDNA三元复合物具有更紧密的压缩球形结构,并具多态性。这种新型复合载体具备更高转染效率的原因可能是壳聚糖对DNA的预压缩,减小了载体的粒径,并提高了对DNA的结合能力。球形复合物由于低表面能而具有高稳定性[27]。与PEI相比,壳聚糖生物匹配性强,免疫原性和细胞毒性低[28],DNA压缩能力高;与单纯脂质体相比,脂质体转染效率偏低,且可引起细胞毒性,如细胞皱缩、减少有丝分裂等[29],而构建的壳聚糖/脂质体/pDNA三元复合载体具有转染效率高、毒性低的特点,是基因治疗潜在的新型非病毒载体[30]。

2.4.4聚酰胺胺(PAMAM)由于合成简单且已商业化等优点,PAMAM已经成为研究最为广泛的树形分子基因载体。研究表明PAMAM可以促进DNA进入细胞,并协助DNA从溶酶体内逃逸。经过修饰的PAMAM转染率更高,毒性更小。Bielinska等[31]研究发现PAMAM与DNA的复合物可以使DNA免受核酸酶的降解。但其也存在递送效率及细胞毒性的问题。

2.5　纳米材料递送系统

基于上述各种基因递送载体的优缺点及目前仍需解决的问题,进一步研究新型递送载体成为生命科学领域探讨的新话题。近年来,随着纳米技术的不断发展,纳米材料为递送核酸进入靶细胞提供了更多的选择。

2.5.1传统纳米材料物质小到纳米尺度(0.1-100 nm)后会出现特殊性能,这种既不同于原来组成的原子、分子,也不同于宏观物质的材料即为纳米材料。纳米材料可轻易进入到生物体内,为构建药物运输系统提供了巨大的优势[32]。各种受到研究者关注的纳米材料,包括脂质体[33,34]、聚合物纳米结构[35,36]、纳米金[37,38]、硅纳米材料[39]、量子点[40]、磁性纳米颗粒[41,42]、碳纳米管[43]等,因其各自的独特性质,成为核酸类药物递送系统的候选材料。

纳米生物技术基因治疗载体系统所具有的诸多优点,为实现基因治疗中目的基因的靶向性、智能化传递以及高效、可控表达提供了崭新的技术平台,具有良好的应用前景。随着纳米生物技术的深入发展,新型纳米生物材料的开发,安全、高效、可控的靶向纳米基因载体,将大大提高基因治疗的疗效。

2.5.2新型纳米分子递送技术Rosette Nanotube(RNT)是美国布朗大学陈迁教授近年来研究的一种新型仿生纳米分子材料,其具有良好的跨膜转运能力。在结构上,它由自动排列的超分子机构组成,基础的结构是鸟嘌呤和胞嘧啶的配对连接。同时RNTs有中空的通道,能够与药物结合,形成一个封装系统,将药物包裹其中完成药物递送。而且其胶囊状的形状也可以有效保护不稳定的miRNA,防止其出现分解。

RNT的管状结构,是由一级结构的赖氨酸侧链和二级结构的氢键在疏水性的相互作用下组成的管状结构,同时它含有疏水性基团,可与中性及带负电的分子络合形成复合物,更好地携带寡核苷酸分子透过质膜。

RNT的特性:①RNTs容易合成,其疏水性外周可快速进行自组装而形成一个环状的纳米管;②仿生的纳米材料结构特点使其容易与细胞黏附;③氨基酸侧链可调节,在使用过程中,可通过调节氨基酸侧链来调整递送功能,以及靶向作用;④可通过侧链的空间分布来增强其功能。这些特性决定了其可以作为一种高效、可靠的细胞递送载体。

由于RNT外层的疏水性,因此其具有相当好的生物相容性及细胞亲密度,并且已经成功地应用于疏水性药物的递送。陈迁教授前期研究集中在RNT材料对肿瘤类药物以及寡聚核苷酸的跨膜转运。2015年张银刚教授与陈迁教授建立骨骼关节研究中心,致力于纳米分子材料与软骨细胞发育分化相结合。西安医学院研究室正在研究此种RNT与寡聚核苷酸相结合,使之形成一种新的纳米柱状结构,将其称为RNTs-siRNA复合物。并且西安医学院研究室前期已经成功地将此技术应用于软骨细胞的分子信标递送过程,实现了分子信标的细胞转运。

3　总结

目的基因、载体和靶细胞是基因治疗的三要素,而构建安全、有效、可控的递送载体为基因治疗的关键,随着人类基因组计划的初步完成,分子病毒学和材料学的发展,在原有以病毒载体为主的基础上,新型非病毒基因治疗载体不断涌现。

以上是目前基因治疗常用的几种递送载体,核酸递送系统中生物类载体(主要是指病毒载体)和非生物载体两大类中有各自的优势与不足。病毒载体虽得到广泛应用,其转染及表达效率高,但病毒载体自身具有免疫原性及潜在的发生突变风险,存在安全隐患。阳离子脂质体用于核酸的转染已有数十年的历史,是目前研究中最有效、细胞毒性最小的非病毒基因传递方法之一,但没有有效的入核机制使其转染效率始终得不到提高。PEI以及PEI/PLA复合物都可以有效地递送siRNA到胞质中,但其细胞毒性也不容忽视。多肽介导的核酸药物递送系统能显著提高药物的透膜性和靶向性,减少其毒副作用,增强疗效,在药物靶向递送系统中也具有广阔的应用前景。不过,肽类载体的制备工艺、脱靶效应及毒副作用是其在核酸药物递送系统应用研究领域中需解决的问题。环糊精的生物兼容性好,然而仍存在体循环稀释稳定性差、内涵体逃逸能力弱和转染效率低等问题。壳聚糖/脂质体/pDNA三元复合载体具有转染细胞高效、低毒的特点,是基因治疗潜在的新型非病毒载体。新型纳米材料递送方式逐渐成为主流,纳米生物技术基因治疗载体系统所具有的诸多优点,为实现基因治疗中目的基因的靶向性、智能化传递以及高效、可控表达提供了新的技术平台,具有很大的应用前景。

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