淫羊藿苷对成骨细胞中β—catenin、ALP和RUNX2表达的影响

周先进+张延芳

[摘要] 骨质疏松是由成骨细胞引导的骨形成小于破骨细胞引导的骨吸收导致的骨量丢失而引发的。按照中医理论，中药淫羊藿能够治疗骨质疏松，有研究表明其特征成分淫羊藿苷能促进骨形成，改善碱性磷酸酶（ALP）活性，调节β-连环蛋白、ALP和特异性转录因子2表达，但对成骨细胞的增殖与分化的影响并不一致。因此，淫羊藿苷应用于临床治疗骨质疏松有较好的前景，但其作用机制还需要进一步的研究。

[关键词] 淫羊藿苷；β-连环蛋白；碱性磷酸酶；特异性转录因子2

[中图分类号] R285.5 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）12（c）-0057-04

[Abstract] Osteopenia is caused by the loss of bone mass when bone formation guided by osteoblasts is less than the bone absorption induced by osteoclasts. According to the traditional Chinese medicine， herba epimedii can treat osteoporosis. Besides， studies have shown that Icariin， the characteristic component of herba epimedii can promote bone formation， improve the alkaline phosphatase （ALP） activity， and also up-regulate the expression of key factor beta-catenin， ALP and runt-related transcription factor 2 of osteoblast. However， Icariin has different effects on the proliferation and differentiation of osteoblasts. Therefore， Icariin has an attractive prospect in clinical treatment of osteoporosis， but its mechanism needs further study.

[Key words] Icariin； β-catenin； Alkaline phosphatase； Runt-related transcription factor 2

骨质疏松（osteoporosis，OP）是一种以低骨量和骨组织微结构破坏为特征，导致骨质脆性增加和易于骨折的全身性骨代谢性疾病，好发于老人及绝经后妇女。世界卫生组织统计，全球患者可达到2亿例，其发病率已经跃居世界各种常见病的第7位，严重威胁着人类的身心健康。OP的防治已经成为世界性课题。目前现有的治疗OP药物存在过敏、食管刺激和价格昂贵等缺陷[1]。而中药在这些方面问题较少，具有价廉易得，副作用小特点。在传统中医理论中，OP属于骨痹范畴。中药淫羊藿，具有潜在的促进骨愈合的作用，可促进成骨细胞（osteoblasts，OB）活性，抑制破骨细胞（osteoclast，OC）分化，具有良好的骨诱导性；其发挥药效的主要成分为黄酮苷类，淫羊藿苷（Icariin，ICA）是其中主要的黄酮苷[2]。β-連环蛋白（β-catenin）、碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase，ALP）和OB的特异性转录因子2（runt-related transcription factor 2，RUNX2）是OB增殖分化的重要指标，本文通过探讨ICA对OB中β-catenin、ALP和RUNX2表达的影响，为中药防治OP提供依据。

1 淫羊藿的衍生物家族

ICA是淫羊藿中的特征成分，能够促进OP动物模型中新骨的形成和骨量的增加。ICA体外水解得到淫羊藿次苷Ⅱ，继续水解得到淫羊藿素，二者都具有与ICA类似的药理学活性[3]。ICA在体外能够促进OB增殖、分化和矿化，从而加快骨形成作用，同时能抑制OC增殖，降低OC吸收功能。

2 ICA对OB的作用机制

当前大量实验结果表明ICA能够促进大鼠骨髓基质干细胞成骨性分化，增强OB中基质的矿化，具有良好的成骨诱导性[4]。其增强OB活性的同时，还可以抑制OC的分化和骨吸收功能，有较强的促骨形成活性，其双重作用能够大大加快骨组织的愈合[5]。

2.1 OB增殖分化的关键因子

OB是骨发生和骨形成的物质基础，也是骨质更新过程中是最重要的功能细胞[6]。在OB增殖分化过程中，细胞因子起着关键作用。Wnt经典信号通路与OB增殖密切相关，而β-catenin是其通路中最关键的因子之一，能反映OB的增殖[7]。ALP是OB早起分化标志物，在OB增殖期能够高表达[8]。RUNX2是OB分化必要的特异性转录因子，对骨组织的形成和重建起着重要作用。

2.2 ICA对OB中β-catenin表达的影响

β-catenin是Wnt经典信号通路中的关键细胞因子，其量的积累是Wnt经典信号通路的关键环节。当Wnt经典信号通路启动时，切断β-catenin的降解途径，β-catenin在胞内聚集，入核替换转录抑制因子与T细胞因子/淋巴细胞增强子结合因子结合，招募转录所需的辅助激活因子，解除抑制，特异激活Wnt下游的靶基因的转录和表达，促进细胞的分化增殖。

近几年来，国内外研究发现Wnt/β-catenin信号通路确实参与了骨形成的过程，ICA能促进Wnt经典通路中关键因子β-catenin表达上调，激活下游靶基因的表达，进而促进OB的增殖分化。在体内实验研究中，发现ICA能上调成骨基因RUNX2表达，抑制OC的活性，增加缺损区骨量，通过经典Wnt/β-catenin途径，有效地促进骨愈合。不同浓度的ICA能促进Wnt/β-catenin信号通路中关键因子的表达，使得β-catenin在胞内聚集，入核激活Wnt经典通路，刺激Wnt下游靶基因的转录和表达，进而促进OB的增殖分化[9]。在体外实验研究中，用含1 μg/mL ICA的培养液培养OB，β-catenin基因表达上调，而加入Wnt/β-catenin抑制剂即DKK1后，β-catenin基因的表达降低，说明Wnt/β-catenin信号通路可能参与了ICA促进OB增殖分化的过程[10]。用不同浓度的ICA干预MC3T3-E1细胞，与ICA和Wnt/β-catenin信号通路抑制剂（Noggin、DKK-1）联合使用干预MC3T3-E1细胞相比，ICA通过上调Wnt/β-catenin信号通路中β-catenin的表达，促进MC3T3-E1前OB的成骨分化[11]。最新研究也证实，Wnt经典通路参与了OB的增殖分化，ICA还能促进前OB分化为OB，并且其与知母皂苷或阿魏酸等配伍使用效果更佳。单独用ICA，知母皂苷或阿魏酸及其组合作用于去双侧卵巢的OP模型，以及培养原代OB，均发现三者组合增强了治疗效果，而不增加对OP小鼠的不良影响，协同增加OB增殖，ALP活性和矿化结节形成，并通过调节OB中的骨形态发生蛋白和Wnt/β-catenin信号通路促进骨基质的表达[12]。也有报道ICA可诱导骨髓基质细胞（MSC）的成骨分化，并通过激活Wnt/β-catenin信号通路促进钛颗粒诱导的溶骨部位的新骨形成[13]或ICA通过激活ERα-Wnt/β-catenin信号通路促进大鼠MSC的成骨分化[14]。endprint

上述研究均显示，ICA能通过激活Wnt经典通路，使β-catenin在胞内聚集入核，促进OB的增殖分化。

2.3 ICA对OB中ALP表达的影响

ALP是广泛分布于人体肝脏、骨骼、肠、肾和胎盘等组织经肝脏向外排出的一种酶。ALP不是单一的酶，而是一组同功酶。ALP活性是OB功能及分化程度的指标，是OB早期分化的标志物。ALP在细胞中表达的多少，反映OB的活性，OB处于增殖期时，ALP高表达。

ICA能使ALP高表达，提高其活性，促进OB增殖分化，抑制骨吸收。ICA可以显著促进钛颗粒作用下的OB增殖，最佳药物浓度为10-9 mol/L，并且在此浓度下的ICA可以显著增加OB中的ALP活性和钙化结节形成[15]。ICA能显著上调ALP的表达，促进骨形成，抑制骨吸收，增强ALP活性，提高OB的活力[16]。

此外，也有研究表明ICA对OB的增殖分化没有显著影响，甚至以剂量依赖性方式抑制OB增殖，但是ALP活性显著增强，ICA以剂量依赖性方式抑制OB增殖，最终浓度为1×10-5 mol/L的ICA可显着增强OB的成骨分化和成熟，表明ICA具有诱导骨形成的活性[17]。不同浓度的ICA培养大鼠的OB，在1×10-5 mol/L的浓度下，对OB的增殖没有显著影响，但ALP活性显著增强[18]。ICA对OB的增殖没有影响，但改善了ALP活性[19]。ICA增强骨髓基质细胞的成骨分化，但对新生大鼠的颅骨OB的分化没有影响[20]。

以上研究表明，ICA对OB增殖分化的作用结论尚不一致，但均能增强ALP的活性。

2.4 ICA对OB中RUNX2表达的影响

Runx蛋白是一类转录因子蛋白的统称，其中RU？鄄NX2是OB分化必须的特异转录因子，对骨组织的形成和重建起着重要作用。目前已发现适宜剂量的ICA能促进OB的增殖分化，同时能使RUNX2的表达上调[21]。最适浓度的ICA对OB分化和矿化比最佳浓度的地塞米松更有效，RUNX2基因表达水平也更高，浓度在10-5 mol/L时，ICA能使RUNX2基因表达水平更高，更好地促进OB分化和矿化[22]。在体外存在或不存在成骨诱导培养的条件下，用ICA作用于骨髓间充质干细胞，ICA均能促进RUNX2的表达，有利于骨形成作用[23]。

近两年的研究也表明，RUNX2的表达上调与OB的增殖分化有较大关联。ICA同样可以通过上调RUNX2 mRNA表达水平来促进BMSCs向OB的分化[24]，ICA最佳诱导浓度为1×10-6 mol/L，与对照组相比，此浓度下ICA能显著增加RUNX2的mRNA和蛋白质表达[25]，用不同浓度的ICA干预培养不同时间，ICA对体外培养的大鼠OB增殖并无显著影响，但可明显促进OB的分化、上调RUNX2蛋白的表达，并且高浓度ICA抑制OB生长[26]。

上述实验结果表明，ICA能促进OB的分化，对于其增殖的影响尚有异议，且能上调成骨分化相关基因RUNX2的表达。

3 展望

ICA能促进OB成骨，抑制OC分化与骨吸收，还能促进MSC成骨定向分化，增强机制矿化功能，且相较于其他治疗骨质疏松的药物，ICA具有毒副作用小，来源广泛，提取工艺简单，价格低廉，易于储存的优势，这些特性有助于其相关新药的开发。并且ICA还能增加心脑血管血流量、促进造血功能、免疫功能，具有抗衰老、抗肿瘤等功效，治疗骨质疏松的同时，可以起到防治其他疾病的作用。

目前，研究均发现ICA能上调β-catenin和RUN？鄄X2的表达，改善ALP活性。ICA对OB增殖分化的影响结论尚不一致，ICA对OB增殖分化没有影响，甚至以剂量依赖性抑制OB的增殖，对骨形成以及骨吸收的作用机制也尚不明确，但也有研究表明ICA能促进骨形成。实验结论不一致，有可能是ICA浓度不同，诱导时间不一樣，或者作用的对象不同，从而导致实验结果的有较大的偏差。因此，还需要进行大量更深入的研究，探讨ICA对OB增殖分化是否有效，达到何剂量起效，最适剂量又是多少，以及ICA成骨的分子机制，为开发ICA相关药物提供依据。

[参考文献]

[1] 闫景刚，段卫华.骨质疏松症治疗药物的研究进展[J].中国医药导报，2015，12（9）：34-37.

[2] 赵喆，雷鸣，肖德明，等.淫羊藿素成骨机制的研究进展[J].中国骨肿瘤骨病，2010，9（6）：543-547.

[3] 张攀，史娟，刘力，等.淫羊藿苷及其衍生物的抗氧化活性研究[J].中国食品添加剂，2016（2）：85-88.

[4] 郭晓宇，李唯，陈克明，等.淫羊藿苷通过PI3K/AKT-eNOS信号途径促进大鼠骨髓基质细胞的成骨性分化[J].中国药理学通报，2013，29（7）：966-970.

[5] 马小妮，葛宝丰，陈克明，等.淫羊藿苷调节成骨细胞骨形成和破骨细胞骨吸收的机制[J].中国医学科学院学报，2013，35（4）：432-438.

[6] 张静如，逢丹丹，戴生明.成骨细胞分化及调节过程[J].中华风湿病学杂志，2016，20（7）：486-488.

[7] 贾忠宝，张柳，田发明. Wnt/β-catenin信号通路主要因子与成骨细胞研究进展[J].中国骨质疏松杂志，2012，18（1）：90-94.

[8] 张英，袁月，孙富丽，等.成骨细胞胞内胞外碱性磷酸酶含量比较[J].中国医科大学学报，2011，40（10）：874-876.

[9] 任翔，吴剑，李嘉航，等.Wnt/β-catenin通路在成骨细胞中的作用[J].现代生物医学进展，2014，14（25）：4991-4993.

[10] 王冉.Wnt/-βcatenin在淫羊藿苷促成骨细胞增殖分化中的作用[D].北京：首都医科大学，2014.endprint

[11] 陈旭凤.淫羊藿苷调控成骨分化的机制研究[D].武汉：华中科技大学，2014.

[12] Li M，Zhang ND，Wang Y，et al. Coordinate regulatory osteogenesis effects of icariin，timosaponin B Ⅱ and ferulic acid from traditional Chinese medicine formulas on UMR-106 osteoblastic cells and osteoblasts in neonatal rat calvaria cultures [J]. J Ethnopharmacol，2016，185：120-131.

[13] Wang J，Tao Y，Ping Z，et al. Icariin attenuates titanium-particle inhibition of bone formation by activating the Wnt/β-catenin signaling pathway in vivo and in vitro [J]. Sci Rep，2016，6：23 827.

[14] Wei Q，Zhang J，Hong G，et al. Icariin promotes osteogenic differentiation of rat bone marrow stromal cells by activating the ERα-Wnt/β-catenin signaling pathway [J]. Biomed Pharmacother，2016，84：931-939.

[15] 林绵辉，史占军.淫羊藿苷对钛颗粒作用下的成骨细胞增殖和表型的影响[J].实用医学杂志，2014，30（10）：1548-1551.

[16] Liang W，Lin M，Li X，et al. Icariin promotes bone formation via the BMP-2/Smad4 signal transduction pathway in the hFOB 1.19 human osteoblastic cell line [J]. Int J Mol Med，2012，30（4）：889-895.

[17] 翟远坤，李志忠，陈克明，等.淫羊藿苷对体外培养乳鼠颅骨成骨细胞增殖、分化及成熟的影响[J].中药材，2011， 34（6）：917-922.

[18] 明磊国，陳克明，葛宝丰，等.淫羊藿苷与染料木黄酮对体外培养成骨细胞增殖及矿化成熟影响的对比研究[J].中国中药杂志，2011，36（16）：2240-2245.

[19] 何伟，李自力，崔元璐，等.淫羊藿苷对大鼠成骨细胞核结合因子α1、骨形成蛋白-2、骨形成蛋白-4 mRNA表达的影响[J].北京大学学报：医学版，2009，41（6）：669-673.

[20] Chen KM，Ma HP，Ge BF，et al. Icariin enhances the osteogenic differentiation of bone marrow stromal cells but has no effects on the differentiation of newborn calvarial osteoblasts of rats [J]. Pharmazie，2007，62（10）：785-789.

[21] Hsieh TP，Sheu SY，Sun JS，et al. Icariin isolated from Epimedium pubescens regulates osteoblasts anabolism through BMP-2，SMAD4，and Cbfa1 expression [J]. Phytomedicine，2010，17（6）：414-423.

[22] Ma HP，Ming LG，Ge BF，et al. Icariin is more potent than genistein in promoting osteoblast differentiation and mineralization in vitro [J]. J Cell Biochem，2011，112（3）：916-923.

[23] 鲍远，黄俊明，靖兴志，等.淫羊藿苷促进骨髓间充质干细胞成骨分化[J].中国组织工程研究，2016，20（24）：3501-3507.

[24] 傅淑平，杨丽，洪浩，等.淫羊藿苷促SD大鼠骨髓间充质干细胞骨向分化作用的实验研究[J].中国中西医结合杂志，2015，35（7）：839-846.

[25] 谢艳芳，王鸣刚，陈克明，等.淫羊藿苷促进胶原水凝胶三维立体培养成骨细胞的成熟分化[J].浙江大学学报：医学版，2015（3）：301-307.

[26] 李玲慧，丁道芳，杜国庆，等.淫羊藿苷对大鼠成骨细胞增殖及碱性磷酸酶、Runx2蛋白表达的影响[J].中国矫形外科杂志，2013，21（21）：2195-2199.

（收稿日期：2017-03-23 本文编辑：李岳泽）endprint