葡萄球菌生物膜形成影响因素的研究进展

陈雅+叶联华+黄云超

[摘要] 细菌感染已成为临床中不能完全避免的情况，包括致病菌和条件致病菌。细菌生物膜成为细菌的有效保护途径，增强了细菌对抗机体的免疫防御作用及对抗生素的抵抗性。葡萄球菌生物膜形成受多因素及多基因调控，外部环境因素主要是机体免疫反应及外界有机物，内部基因调控主要是sarA、agr、aap、ica。本文就葡萄球菌生物膜的形成及影响生物膜形成的外部环境因素和内部基因调控因素进行综述，为葡萄球菌生物膜的靶向药物研究与治疗提供参考。

[关键词] 细菌生物膜；基因调控；sarA蛋白；agr基因；ica操纵子

[中图分类号] R378 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）12（c）-0037-06

[Abstract] Bacterial infection has become a clinical situation that can't completely avoid， including pathogens and conditioned pathogens. Bacterial biofilm becomes an effective way to protect bacteria， increases the bacteria against the body immune defense and the resistance to antibiotics. Staphylococcus biofilm formation affected by multiple factors and multi-gene regulation， including the external environmental factors， such as organism immune response and external organic matter， the internal genes regulation are mainly sarA， agr， aap， ica. This paper summarizes the formation of Staphylococcal biofilm， the external environmental factors and internal gene regulation factors that affecting biofilm formation， which can be used as a reference for the study and treatment of Staphylococcal biofilm targeted drugs.

[Key words] Bacteria biofilm； Gene regulation； SarA protein； Agr gene； Ica operon

致病细菌一旦通过人类呼吸道、伤口进入人体将会导致感染，引起一系列临床症状。据调查显示，有超过80%的人类伤口慢性感染是与生物膜相关的，这种感染最常见于表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和腸杆菌，如大肠埃希菌[1]。当细菌侵入机体后，可以附着在生物和非生物表面，并形成由黏多糖、蛋白质等组成的生物膜，生物膜一旦形成，细菌可适应机体微环境，引发耐药性和炎症，并导致持续性感染。

近年来，关于细菌生物膜形成机制、相关基因调控、导致持续性感染、抑制生物膜形成相关因素等方面的研究迅速发展。本文就关于葡萄球菌生物膜形成及其影响因素进行综述。

1 细菌生物膜定义及形成

细菌生物膜是细菌嵌入自身所产生的细胞外基质后所形成的一个多细胞的三维结构[2]，并且在生长速度和基因转录方面表现出特定的表型。生物膜包括三个基本成分：细菌本身、基质以及表面液体或液体-空气界面。生物膜基质由细菌产生，其主要成分由水和细胞外聚合物（也称多糖-蛋白质复合物或者黏液层）组成。生物膜基质为黏附群体提供了建筑结构和保护，赋予了自由浮动的细菌不可能完成的生理和代谢能力[3-4]。

金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌同属于葡萄球菌，前者能产生凝固酶，是致病菌，后者是条件致病菌，但是它们生物膜的形成过程是相似的。其生物膜形成主要包括4个步骤：黏附、聚集、成熟、播散。①黏附：生物膜形成的初始步骤是细菌对异物或者生物材料表面的黏附。细菌在黏附前的表面调节是生物膜形成的重要前提。如：生物材料植入血液中时，材料的表面被血液中的白蛋白、补体因子、黏蛋白等吸附，并且快速修饰，这种调节永久地改变了生物材料的表面，并且能够促进细菌的黏附[3]。而细菌自身产生的特异性蛋白也能介导其本身与非生物表面的结合，如葡萄球菌中的自溶蛋白（autocytolysin，AltE）。②聚集：细菌不可逆地附着在生物或非生物表面便开始形成非常独特的微生物聚集体，称为微菌落[5]。每个细菌都能产生自诱导物，细菌达到一定的密度，其周围环境信号分子累积，当达到阈水平时，细菌之间就能“交流”，最终使整个群体可以做出协调的反应，这就是群体感应。群体感应可以修改细菌群体行为，使其整体执行相应的功能。③成熟：随着细菌聚集、增殖以及细菌间群体感应的整体调节，生物膜的密度及其复杂性迅速增加，多层次的细菌形成，包埋在生物膜中的细菌会分泌许多生物膜“支架”，如蛋白质、DNA、多糖等，而且细胞外聚合物大量产生，这就形成了一个复杂的三维空间结构，细胞外聚合物形成的封闭三维空间散布着开放的通道，便于将必需营养物质和氧气输送到生物膜内生长的细胞中[3-6]。④播散：当生物膜达到一定的临界质量，在已形成的稳定生物膜的最外层的细菌可以通过解吸、脱离和分散，从生物膜释放并附着于其他生物或非生物表面。这一过程与群体感应系统的调控密切相关[7-8]。endprint

以上4个步骤是生物膜形成的过程，在实际中是不断循环的。黏附是一处表面生物膜形成的开始，而播散却又为另一处表面生物膜形成的开始提供必须的材料。当然，细菌生物膜的形成受许多因素影响，包括机体内外因素及细菌自身的基因调控。

2 环境因素对细菌生物膜的影响

生物膜的发育与成熟取决于许多环境的信号，这些信号包括生物因素、化学因素和物理因素，如宿主本身反应、环境中营养成分、PH、温度等。然而许多研究表明，宿主体内外许多因素会影响生物膜的形成与定植，这些因素包括：宿主细胞、类固醇（如：黄体酮、雌激素、脱氢表雄酮等）[9]、乙醇、疏水蛋白等。

机体细胞对生物膜形成的影响

2.1 机体细胞对生物膜形成的影响

2.1.1 多形核白细胞（polymorphonuclear leukocytes，PMNs） 葡萄球菌一旦感染宿主，宿主先天免疫应答会本能地与之对抗。先天免疫应答对葡萄球菌的影响是一个非常复杂的过程。在先天免疫系统中，PMNs和巨噬细胞对葡萄球菌感染最先做出应答反应，人类的PMNs能定位于葡萄球菌生物膜，从初级和次级颗粒中释放颗粒组分，并吞噬生物膜细菌，抵抗细菌生物膜的形成[10]。

一般来说，对葡萄球菌生物膜相关感染的宿主免疫应答不能完全清除感染。在生物膜存在的情况下，生物膜中的细菌会刺激人嗜中性粒细胞和巨噬细胞，使其黏附和吞噬作用显著增强，而表皮葡萄球菌生物膜胞外多糖及胞间多糖黏附素（polysaccharide intercellular adhesion，PIA）在降低人嗜中性粒细胞和巨噬细胞吞噬能力方面起着重要作用，这是由于表皮葡萄球菌PIA阳性生物膜能促使C3a释放，C3b和IgG在表皮葡萄球菌生物膜表面沉积减少，从而有助于表皮葡萄球菌逃避PMNs所介导的杀伤作用。因此生物膜相关感染会逐步转变为慢性感染[11-12]。故如何抑制表皮葡萄球菌逃避先天免疫应答将会有重要的研究价值。

2.1.2 成骨细胞 成骨细胞是骨形成的主要功能细胞，负责骨基质的合成、分泌和矿化。在骨重建形成骨吸收陷窝中，成骨细胞分泌骨基质，骨基质矿化而形成新骨。而在骨科植入材料中出现葡萄球菌生物膜感染情况下，不仅中性粒细胞会参与免疫反应，而且成骨细胞同样也会产生一定作用。成骨细胞能对细菌细胞外聚合物的成分作出反应，如细菌热休克蛋白GroEL能使细胞表面的相关标记活化和氧自由基生成增加，该反应主要是成骨细胞通过增加的促炎细胞因子的产生来应答，反过来可以吸引免疫感受态细胞，从而可能引发或延续对生物膜感染的防御[13]。

有研究报道，在被金黄色葡萄球菌感染的骨髓炎中，成骨细胞在细菌感染下能产生白介素-6，白介素-6是细菌感染中重要的免疫因子，它能增强细胞介导的免疫应答反应。不仅如此，白介素-6还能增强CD4+、CD25+T细胞活性的调控，促进免疫应答的发展进程[14]。因此成骨细胞可能在对生物膜感染的防御机制方面有极为重要的研究前景。

2.2 类固醇激素对生物膜形成的影响

类固醇激素又称甾体激素，包括孕激素、雌激素等。在对金黄色葡萄球菌的研究中发现，类固醇激素能抑制葡萄球菌对氨基酸的摄取，如：孕激素的量超過一定值（约15 μg/mL）可以抑制氨基酸摄取，这可能是因为类固醇可以作用于细胞膜中的特异性摄取系统，延缓葡萄球菌的生长，而不大量渗透到细菌细胞内，在某种程度上影响细胞壁或者细胞膜的细胞外因子[15]。

佩尔泽等[16]研究表明，①卵巢类固醇激素（雌二醇和孕酮）能够调节一些微生物物种的体外生长；②滤泡液支持微生物的长期存活。雌二醇是女性卵巢分泌的类固醇激素，是主要的雌激素，负责调节女性特征、附属性器官的成熟和月经—排卵周期，促进乳腺导管系统的产生。而在雌二醇与表皮葡萄球菌的研究中，当雌二醇浓度≥125 pmol/L时形成的生物膜明显增厚，在细菌培养的4、6 h阶段虽对细菌增殖有一定的抑制作用，但是在培养的12 h阶段却又有促进作用，在24 h达到最厚；当雌二醇浓度较低（≤50 pmol/L）时，细菌形成生物膜厚度比高浓度组和空白组均薄。这表明雌二醇对生物膜形成有一定的抑制作用，但是存在剂量依赖关系，只有在低浓度情况下才能发挥其抑制生物膜形成的作用[17]。雌二醇对葡萄球菌生物膜形成的影响可为乳腺假体等生物材料植入感染的研究提供新方向。

2.3 外界有机物对细菌生物膜形成的影响

2.3.1 乙醇 目前医疗中乙醇或者含有乙醇的溶剂是应用最广泛的消毒剂。尽管乙醇被认为是有效的杀菌物质，但是在使用乙醇杀菌后所残存的少许细菌仍可继续存活和繁殖。殊不知，乙醇若未能完全杀灭葡萄球菌则就能够有效促进葡萄球菌生物膜的形成。葡萄球菌在乙醇环境中的应激能诱导其PIA的合成以及不依赖于rsbU的生物膜形成，如金黄色葡萄球菌在乙醇环境下通过取代rsbU从而激活σB或者通过σB的独立途径激活PIA的表达来促进生物膜形成，这是由于乙醇可以上调ica的表达，促进生物膜的形成[18-19]。

2.3.2 疏水蛋白 众所周知，疏水蛋白可以将蛋白质固定在物质表面，从而为常规物质常规表面改性提供了非共价选择。而疏水蛋白涂层表面却可以有效防止葡萄球菌生物膜形成。在表皮葡萄球菌中，疏水蛋白涂层不是通过降低参与非生物表面的细菌蛋白的亲和力来抑制表皮葡萄球菌生物膜形成，其抗生物膜效应主要是在生物膜形成的早期阶段，可能与生物膜细胞外基质的细胞外DNA（eDNA）相互作用密切相关。eDNA在表皮葡萄球菌初始黏附阶段起着关键性的作用。而在金黄色葡萄球菌中，虽然eDNA对初次附着没有任何影响，但是在从附着阶段到聚集阶段的转变过程中起关键作用[20]。疏水蛋白涂层与细菌eDNA的相互作用机制有待进一步研究，可为防止生物材料植入后葡萄球菌感染提供重要研究价值。

3 基因调控表达与细菌生物膜形成的关系endprint

葡萄球菌生物膜的形成与许多相关基因调控表达密切相关，如：sarA（staphylococcal accessory regulator A）、agr（accessory gene regulator，agr）、aap（accumulation-associated protein）、ica等，各类基因调节表达在生物膜不同阶段发挥特异性功能并影响着生物膜的形成。

3.1 sarA对生物膜形成的影响

3.1.1 sarA的结构功能 在葡萄球菌的研究中发现，葡萄球菌中存在一类sar蛋白家族，该家族中存在的蛋白包括：括sarA、sarR、sarS、sarU、sarX、sarV、Rot、mgrA等，它们相互作用形成一个复杂的调节网络[21]。该家族中sarA是一种14.5 kD，含有124个氨基酸残基的全局转录调节蛋白，可以直接或者间接调控超过120个基因（包括agr下游靶基因的转录），控制细菌细胞中许多与毒性相关的基因表达，能直接调控多种毒力因子的产生[22]。

sarA有3个明显的启动子——P1、P2和P3，其中P1是最主要的启动子。当与sarA同源的sarR与P1结合，同时sarB与P3结合时能抑制sarA的表达，使细菌胞外蛋白质分布改变，减少细菌与纤连蛋白原结合，还能影响agr中RNAⅡ和RNAⅢ的表达水平。sarA还能与其上游一段富含AT的序列结合，从而在转录水平控制ica、altE等基因的表达。atlE是一种115kDa的蛋白质，属于一种在细菌细胞壁降解中发挥关键作用的细菌肽聚糖水解酶，它能在细胞壁中起运输流通作用，还参与促使表皮葡萄球菌黏附于塑料表面的能力[23]。

3.1.2 sarA与生物膜形成的关系 sarA的表达可促进葡萄球菌生物膜的形成，而当sarA被抑制时则抑制了生物膜的形成，这主要是由于sarA的表达与否与细菌结合纤连蛋白原的能力、蛋白酶的产生息息相关，这两者共同作用影响着葡萄球菌生物膜的形成能力；同时当sarA被抑制时还能在体内外增加细菌对抗生素的敏感性——当sarA被抑制时，葡萄球菌生物膜形成能力减弱，感染组织中浮游生长的葡萄球菌增多，与完全完整的生物膜相比，这大大增加了抗生素和机体免疫应答对葡萄球菌的接触面与接触时间[24-26]。

sarA还是一个中心调节元素，能够直接調节一些基因来影响细菌生物膜的形成。如：sarA可以通过直接结合启动子正向调节bap（bap是金黄色葡萄球菌的一种细胞壁黏附素）；sarA对多糖黏附素（PIA）的合成起至关重要的作用，sarA的缺失会导致PIA合成减少，当然这是基于sarA是icaABCD操纵子的转录激活子，它控制着icaABCD的表达进而影响PIA的合成[10，27]。

3.2 agr对生物膜形成的影响

附属基因调节子系统由约3.5 kb的一段序列编码，编码群体感应系统，该序列包含RNAⅡ和RNAⅢ两个相对独立的转录单位。其转录取决于各自P2和P3 agr启动子的活化。研究表明，agr调控葡萄球菌生长主要是在指数期和稳定期[28-29]。agr群体感应系统是通过感测生长间期葡萄球菌所产生的自动诱导肽（autoinducing peptides，AIPs）的细胞外水平而起作用的。在生物膜形成的起始和成熟阶段agr是低表达的，而在生物膜成熟后期agr表现为活化。agr诱导导致细菌的酶和毒素上调而黏附素下调。

3.2.1 RNAⅡ RNAⅡ由4个基因组成，分别是agrA、agrB、agrC和agrD。通过agrD基因的的转录合成AIPs的骨架。agrB转录的产物是一种蛋白酶，其切割agrD产物的部分以形成长度为约8个氨基酸的硫醇内酯环结构，即为AIPs[21，29]。AIPs作为信号分子，以浓度依赖关系参与群体感应基因转录。agrC和agrA分别对应于细菌中经典双组分调节系统的感应传感器和响应调节剂，当AIPs达到阈值浓度，可通过与跨膜蛋白结合激活agrC，在sarA的辅助下促进agrA的磷酸化或去磷酸化，从而激活启动子P2和P3，最后导致RNAⅡ和RNAⅢ的转录[29-30]。

3.2.2 RNAⅢ RNAⅢ是agr系统的主要下游效应物，通过与其下游基因的翻译元件相互作用而起作用，如：通过RNA碱基配对在翻译水平上影响其靶基因表达；抑制翻译起始；其转录后调节毒力因子的表达和Rot转录调节因子。Rot是一个多效性调节子，影响多种毒素和表面蛋白的表达，也可以通过影响mRNA稳定性、促进或抑制mRNA翻译来调节转录后水平基因的表达[28]。Rot的表达水平与agr密切相关，尤其是与其中的RNAⅢ表达水平呈负相关。Rot蛋白是维持金黄色葡萄球菌生物膜完整性所必需的关键调控蛋白。具体来说，agr失活导致RNAⅢ表达减少，RNAⅢ不能抑制Rot翻译，这就增加了Rot介导的蛋白酶基因转录的抑制，促进分泌的蛋白酶的活性增高，导致生物膜形成。有研究表明，在葡萄球菌生物膜中观察到agr操纵子和agr系统的调节分子在RNAⅢ中的基因表达显著降低[29-31]。

3.2.3 agr与生物膜播散的关系 在生物膜成熟阶段中的agr活性是被抑制了的，agr为低表达，而随着生物膜的发展，从生物膜上分散的小细菌菌落中显示出高水平的agr活性，AIPs能诱导agr的活化，同时生物膜的分散也通过agr蛋白酶调节系统介导。agr的激活可导致编码细胞表面蛋白、黏附素蛋白A、sasG、sasC和纤连蛋白结合的基因下调。因此，agr在浮游细菌和生物膜之间的存在方式起着重要调控作用，有助于金黄色葡萄球菌的分散和新的表面黏附[10，32]。另外一类agr调节生物膜分散的因子是水溶性苯酚效应（phenol-soluble modulins，PSMs），PSMs是金黄色葡萄球菌群体感应依赖性生物膜结构和分离的关键效应分子，在生物膜成熟后，agrC可促进PSMs物的产生使细菌从成熟的生物被膜中分离开来，发生远处播散，引起其他器官的感染或导致感染迁延不愈[24，33-34]。那么，如何通过agr来抑制群体感应进而抑制细菌生物膜形成已经成为当今研究的热点和难点。endprint

3.3 aap结构及对生物膜形成的影响

在表皮葡葡萄球菌RP62A菌株中，aap是140 kD的蛋白质，由N端信号肽、A结构域、B结构域、P/G富集结构域和C端LPDTG细胞壁锚链基序组成。aap是一个多结构域蛋白，在A结构域的N末端含有可变数量为16个氨基酸的重复序列。B结构域包含3～12个重复的128个氨基酸的G5和E结构域。G5能自我结合，因此它是B结构域重复功能重要组成部分，可协调app依赖的细胞间相互作用；E结构域位于G5之间，可能防止蛋白质的错误折叠。B结构域是aap蛋白中变异最大的区域，不同菌株aap蛋白在该区域所含有的重复序列不同，而B结构域和小碱蛋白异型交互作用是生物膜基质的一个组成部分，有助于aap依赖的生物膜形成[35-36]。通过Zn2+依赖性机制作用于暴露的B结构域可促进细菌细胞聚集黏附，促使相邻细胞间的亲和及相互作用[37]。研究表明，在葡萄球菌RP62A培养时，aap出现在其生物膜形成的黏附阶段的细胞外蛋白中，且仅在生物膜形成过程中观察到细胞外液中aap的存在，在浮游的细菌细胞中aap不被表达，因此认为其与表皮葡萄球菌的黏附和聚集密切相关[38-39]。

3.4 ica对生物膜形成的影响

3.4.1 ica结构及功能 ica基因座存在于细菌染色体，全长约3.4 kb，其包括调节基因icaR以及4个串联基因icaA、icaB、icaC、icaD。icaABCD共同参与编码，合成表皮葡萄球菌PIA[40-41]。PIA是由多聚-β（1-6）-乙酰氨基葡萄糖及线性糖胺聚糖组成，它是介导表皮葡萄球菌生物膜形成聚集阶段的必需物质，有助于细菌逃避宿主免疫反应，还能介导生物膜对亲水表面的依从性。icaA的产物是由UDP-N-乙酰葡糖胺合成PIA寡聚物的N-乙酰葡糖胺基转移酶，具有活性。icaB的产物是负责PIA部分脱乙酰化的N-脱乙酰酶，icaC的产物参与新生多糖向外部分泌和形成，而icaD的产物为icaA的编码与合成提供了最佳的效率[42]。葡萄球菌细胞膜外聚合物包括PIA、eDNA、蛋白质、淀粉样蛋白样纤维等，它们共同为细菌的黏附与聚合提供了结构基础，其中最为重要的就是PIA。目前的研究表明，ica不仅与葡萄球菌生物膜的形成相關，而且在医源性材料或器械相关感染中也起着重要的作用[43]。因此，ica操纵子的表达已成为评价表皮葡萄球菌感染致病性的毒力标志，且细菌生物膜形成阳性的表皮葡萄球菌大多存在ica操纵子[21，41]。

3.4.2 icaR 位于表皮葡萄球菌和金黄色葡萄球菌中icaABCD操纵子上游分离转录的icaR基因是转录调节因子tetR家族的成员，大约为22 kD的蛋白质，在icaR mRNA的5′和3′非翻译区碱基配对控制其在葡萄球菌中的转录。icaR基因编码的产物在葡萄球菌中ica操纵子表达的环境调节中具有转录阻遏物的作用，其通过结合到细菌DNA的5′端的icaA，在icaA-icaR基因间区域的短核苷酸序列中可以直接影响icaADBC的表达。此外，在icaABCD与icaR同时存在的菌株中，外部环境变化（如：乙醇、葡萄糖加入）可以促使icaABCD操纵子的表达增加，促进生物膜的形成[44-45]。ica操纵子是调节葡萄球菌生物膜形成的重要基因，不仅受sar、icaR调控影响，也受luxS、rbf、ccpA等基因调控蛋白的影响，因此对ica操纵子的多样性研究有待更深入的探索与发现。

4 展望

生物膜是细菌形成的一种常见结构，对细菌本身来说，它对细菌的生存、增殖和转移起着重要作用；而对人类来说，生物膜的存在却是巨大的担忧，生物膜让细菌对抗生素治疗不敏感，降低疗效。由于生物膜的形成复杂，参与因素多，所以近年来对生物膜的研究也呈多样化发展的趋势，因为每一个参与生物膜形成的必要因素均可能成为攻克生物膜的突破点。但也是由于生物膜的形成复杂，所以研究进程缓慢，不够深入，有些问题需要进一步探究，如：不同类固醇激素浓度如何影响细菌生物膜形成；如何以ica、agr等相关基因为靶点作为抗细菌生物膜形成或促进细菌生物膜崩解的临床药物研究等。因此，防止细菌黏附聚集和消除已建立的生物膜，对于一个创新的科学界来说是越来越大的挑战。

细菌生物分子的研究可能是未来生产有效的抗菌策略的关键，这些策略专门针对根除病原菌，这种方法可以解决感染，达到治疗目标，减少潜在的全身副作用，而不会增加抗生素耐药性的威胁。为了实现这些目标，细菌基因型必须系统地与生物分子途径相关联，从而允许最佳靶向的筛选。

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（收稿日期：2017-11-12 本文編辑：王 娟）endprint