二元联合作用藻红外测试方法——以重金属为例

贺栋才，李星广，郭蔚华,*，林艳，杨鹏飞，刘晨茜

1. 四川省成都市市政工程设计研究院，成都 610023 2. 重庆大学城市建设与环境工程学院，重庆 400045

化学污染物对自然水体的污染已成为全球性的环境问题[1]。检测各污染物的环境浓度水平、评价其毒性和环境风险一直是科学界和大众关注的焦点[2]。在实际水环境中，往往有多种化学污染物同时存在，生物体通常暴露于混合的污染物中，它们对机体同时作用产生的生物学效应(联合作用)与任何一种化学污染物分别单独作用所产生的生物学效应完全不同[3]，因此，分析化学污染物之间的联合作用是必要的。

微藻是水体中食物链的初级生产者，个体小，多为单细胞，对水环境污染敏感，可作为受试材料分析化学污染物间的联合作用对自然水体的生态风险。铜绿微囊藻(Microcystisaeruginosa)对化学污染物的胁迫作用极为敏感[4]，其中滇池铜绿微囊藻生长快[5-6]、饱和密度高，是测试分析化学污染物急性毒性和联合作用的理想受试生物材料。藻类光合作用的电子传递链被抑制时，藻类天线色素吸收的光能会产生剩余激发能[7]，剩余激发能将以红外辐射方式向藻细胞外扩散。此外，许多化学污染物可使酶蛋白变性[8]影响藻的光合磷酸化、氧化磷酸化的能量代谢[9]。因此，化学污染物作用光合电子传递链和呼吸电子传递链所产生的热辐射叠加后更易被仪器测试。有研究报道，Cd2+[10-11]，Hg2+、Pb2+、Cu2+、Zn2+[12]，乐果[13]，莠去津[14]，敌草隆、百草枯、阿特拉津[15]等对藻光合电子传递有抑制作用，红霉素、环丙沙星、磺胺甲噁唑等抗生素[16]，甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂[17]，硝磺草酮[18]，Ni、Zn、Al[9]等对藻光合磷酸化、氧化磷酸化有影响。藻类暴露于重金属、农药、有机化学药品、抗生素等有毒物质时，能产生强于其他微生物的更强的能量变化，可以用红外测温仪检测到藻类的红外辐射变化[19-22]。

藻红外测试法和发光细菌法属急性毒性微生物测试法，具有灵敏、快速、简便的特点[23-29]。相比较而言，作为受试生物材料的藻类分布广泛、藻种丰富、藻源充足，藻种的采取、纯化、扩大、培养等容易，藻种获取成本低，测试用藻有保障，同时，红外测温仪价格远低于发光细菌法所用的检测仪，因而藻红外技术更能满足一般科研院所、科研团队和基层部门对技术的需求。

建立联合作用藻红外测试技术极为复杂，要考虑测试条件、测试藻种、藻温测试方法、藻响应药品的评价方法、联合作用评价方法[30]、联合作用偏差f值的修正、药液配制的标准、数据处理软件等技术环节。在联合作用测试[31-32]中不断发现问题，为保证与控制测试结果的质量，已完善了测试条件，改进了藻温的测试方法[33]，修正了f值，确立了药液配制的参照浓度分析方法等。二元联合作用测试是多元联合作用分析的基础，所建立的联合作用藻红外测试方法能否测试分析联合作用、效果如何等问题仍需要实验检验。化学污染物的种类繁多，实验以种类数相对稳定的重金属作为测试药品，进行重金属二元联合作用藻红外测试方法的验证研究。

本文将通过药品的参照浓度分析确定测试药液的配制浓度，进行重金属二元联合作用测试，分析测试结果的多样性、再现性、重现性，检验测试效果，确定二元联合作用藻红外测试方法的可行性。

1 材料与方法(Materials and methods)

1.1 实验材料

实验用藻为滇池铜绿微囊藻(Microcystisaeruginosain Dianchi Lake in China)，藻种及其培养基配方由中国科学院武汉水生生物研究所提供。测试药品为CuSO4·5H2O、FeCl3·6H2O、MnSO4·H2O、AlCl3·6H2O、CrCl3·6H2O、HgSO4、Cd(NO3)3·H2O、Pb(NO3)2、ZnCl2，为国产分析纯，药液浓度为重金属浓度(g·L-1)，药液现测现配。仪器设备包括ST60便携式红外测温仪(灵敏度0.1 ℃)，购自福禄克测试仪器(上海)公司重庆分公司；HETTICH-EBA离心机，购自球兴科仪国际贸易(上海)有限公司；LRH-250A生化培养箱(灵敏度±0.2 ℃)，购自韶关市泰宏医疗器械有限公司；MOTICBA200数码显微镜，购自上海中恒仪器有限公司；DR/4000U分光光度计，购自北京普析通用仪器有限责任公司。测试杯为直径4 cm、高3 cm、厚0.1～0.2 cm的透明绝热塑料容器。

1.2 数据分析软件

测试藻温处理与联合作用分析可由软件完成或人工完成。所用软件有：①AITAS (Algae Infrared Toxican Analysis Software)藻红外急性毒性分析软件，用于分析藻对药品浓度或样品的响应；②AITHCAS (Algae Infrared Time and Half Concentration Analysis Software)藻红外倍半浓度分析软件，用于分析同药倍半关系浓度；③AICEAS (Algae Infrared Combined Effect Analysis Software)藻红外联合作用分析软件，用于分析药品间的联合作用类型。上述软件AITAS、AITHCAS、AICEAS由郭蔚华、祁小明等开发。

1.2 藻温测试方法

为了提高藻对药液响应的评价效率，将原来的藻温测试10遍改为9遍，因此在1.3.3中指标③的藻响应率由原来的≥60%改为≥55%。

藻温测试在室内条件下进行，采用散射日光或人工光源采光。实验的藻液用量为5 mL·杯-1，藻密度≥3.16×109个·L-1；测试杯加藻液前，藻液充分摇均；当培养时藻增长率≤0时，藻液不再用于实验；测试一种药物的联合作用时，使用同一批培养的藻液。滴加药液前，药液充分摇匀。

当测试杯排放好后(图1、图2)，每个测试杯中加入5 mL藻液，进行加药前测温记录，每杯每次连测3个藻温。然后滴加药液，其中，蒸馏水毒性测试时用滴液管分别滴加蒸馏水1滴(约0.05 mL)于加药组、对照组的测试杯中，重金属毒性测试时用滴液管分别滴加药液、蒸馏水各1滴于加药组、对照组的测试杯中，立即进行加药后的测温记录，每次每杯连测3个藻温。测温时，红外测温仪头部距离藻液正上方10～15 cm，指示红色光点对准藻液面中心时测温。每杯每次连测3个藻温，用于计算平均值。测温顺序：从上到下，从左到右。测温遍数：3个重复测温完毕时即为测温1遍。药液滴入藻液后到藻产生响应有一个过程，藻对不同药液的响应过程不同，加药前测温1遍，加药后测温9遍。前一遍测温完成后接着下一遍测温。

藻温记录：按照测试项目的测试杯布局方式、测温要求制作藻温记录表，测温时将藻温记录于表中。

1.3 藻温处理

1.3.1 藻温处理方法

T=(Tn1+Tn2+Tn3)/3

(1)

Tni=(Tb1+Tb2+Tb3) /3

(2)

Tbi=(T1+T2+T3) /3

(3)

其中，T为每遍测温的处理组藻温；Tn1、Tn2、Tn3分别为3次重复的平均藻温；Tni为重复组的平均藻温，i=1,2,3；Tb1、Tb2、Tb3分别为空白、对照、加药的测试杯的平均藻温；Tbi为每个测试杯的平均藻温，i=1,2,3；Ti为每个测试杯连续测试的藻温(3个藻温)，i=1,2,3。

1.3.2 藻温差计算方法

ΔT=∣ΔTj∣-∣ΔTd∣, ΔT>0

(4)

ΔTj=(Tj- ti-Tj-t0)-(Tk-ti-Tk-t0)

(5)

ΔTd=(Td-ti-Td-t0)-(Tk-ti-Tk-t0)

(6)

上式(4)、(5)、(6)分别为藻响应温差，加药组藻温差和对照组藻温差的计算方法。其中，Tj-ti为加药后加药组的藻温；Tj-t0为加药前加药组的藻温；Tk-ti为加药后空白组的藻温；Tk-t0为加药前空白组的藻温；Td-ti为加水后对照组的藻温；Td-t0为加水前对照组的藻温；j为加药组，滴加药液；d为对照组，滴加蒸馏水；k为空白组，不滴加药液或蒸馏水；ti为测温遍数，i=0，为加药前的测温；i=1, 2,…,9为加药后第1, 2,…,9遍测温。

1.3.3 藻对药液响应的三指标评价法

当藻温差同时满足下面3个指标时，即为藻对药液产生响应。

指标①—最大藻温差比较值，即加药后9遍测温中，︱ΔTj-max︱>︱ΔTd-max︱。

指标③—藻响应率(ψ)≥55%，即加药后9遍测温中，∣ΔTj∣>∣ΔTd∣的出现次数≥5。

1.3.4 首测结果的再现性、最终测试结果的重现性

首测结果的再现性用于分析第一次测试结果的可信性，最终测试结果的重现性用于分析最终测试结果的可靠性。

首测结果的再现性=(与首测结果相同的结果数/实验数)×100%

再现性的出现率=(具有再现性的结果数/总结果数)×100%

最终测试结果的重现性=(相同结果数/实验数)×100%

重现性的出现率=(具有重现性的结果数/总结果数)×100%

1.3.5 联合作用最终测试结果的确认

在3次相同测试中，具有重现性的结果即为联合作用最终测试结果。

1.4 联合作用的评价

1.4.1 联合作用指数偏差法

二元联合作用采用联合作用指数偏差法进行评价。联合作用指数(θ)的计算式为

(7)

其中，θ为联合作用指数；△TABmax为A、B药联合时产生的藻最大响应温差；△TA为△TABmax出现的测温遍数时，A药的藻响应温差；△TB为△TABmax出现的测温遍数时，B药的藻响应温差。

1.4.2 评价方法

θ> 1+f

协同作用(Synergistic effect)

1-f≤θ≤ 1+f

相加作用(Additive effect)

当θ<1-f时：

△TABmax

△TABmax>max(△TA, △TB) 独立作用(Independent effect)

1.4.3 用于联合作用指数θ分析的藻响应温差

θ分析用的联合药液的藻响应温差：联合药液的藻响应通过三指标法，在9遍测温结果中最大的藻响应温差(△TABmax)用于θ分析。

游粱式抽油机具有结构简单和可靠性高等优点,使其在采油设备中有广泛的应用。抽油机都采用较大功率驱动电机来解决启动问题,但正常运行时效率低下。抽油机的数量巨大,因而抽油机的节能降耗研究具有重要的意义[1]。为此进行了大量的探索,这些探索工作可以分成两类,对抽油机机械结构的优化和对电机运行特性的改善。当抽油机上冲程时电机处于电动状态;下冲程时,电机处于发电状态会产生“泵升电压”。这部分能量通常采用外接功率电阻,以能耗制动的方式将这部分能量消耗掉。虽然这种方案结构简单,容易实现,但是功耗电阻的发热有可能引发安全问题并缩短设备寿命,更重要的是造成了能量的浪费不利于油田的节能降耗。

θ分析用的单药药液的藻响应温差：指标①中最大藻响应温差(△TABmax)出现时刻(测温遍数)的单药的藻响应温差(△TA、△TB)用于θ分析。单药的藻响应温差0时，以0计。当△TA=0、△TB=0同时出现时，重新测试藻温。

1.5 联合作用测试分析

步骤依次为参照浓度分析、联合作用测试、联合作用评价和重现性分析。

1.5.1 参照浓度的分析

参照浓度是指联合作用测试时药液浓度的配制标准。分析步骤依次为藻响应药品的浓度梯度分析、敏感浓度分析和参照浓度分析。

(1)藻响应药品浓度梯度的分析

图1 倍半浓度梯度的测试杯布局Fig. 1 Arrangement of cups in test

药液浓度梯度设计为N、N/2、N/4、N/8、N/16、N/32 (单位为g·L-1)，即倍半浓度梯度法。测试杯布局见图1。

藻温测试方法见1.2，藻温现测现记。藻温分析可用软件分析，将测试的藻温输入AITAS 软件，分析藻响应药品浓度范围。藻温分析也可用人工分析，将测试的藻温用1.3.2、1.3.3方法分析藻响应药品浓度范围。如果没有找到藻响应药品浓度范围，重新设计药液浓度梯度再测试。

(2)藻响应药品的敏感浓度分析

藻响应药品的敏感浓度(简称敏感浓度)是指药品浓度增减引起藻响应温差增减的药品浓度。首先进行同药倍半关系浓度的初步分析。同药倍半关系浓度是指引起藻响应温差倍半变化的同一种药的倍半浓度。因同药一分为二测得的联合作用为相加作用，用它来分析药品的敏感浓度。可以用软件分析，将测试的藻温输入AITHCAS，分析药品的同药倍半关系浓度。也可用人工分析，将测试的藻温用1.3.2、1.3.3方法分析各浓度的藻响应温差，再用1.4.3的方法，找出联合药液的最大藻响应温差、单药药液的藻响应温差，进行联合作用指数θ计算(由于只有1个单药的藻响应温差，计算时单药的藻响应温差用乘以2来处理)，再根据联合作用评价方法(1.4.2)分析同药倍半关系浓度是否为相加作用。分析结果为相加作用，进行下一步分析。否则，重新测试。

接下来进行同药倍半关系浓度的再现性分析。对初步分析的同药倍半关系浓度再进行2次相同测试，如相加作用结果能够再现，即通过再现性分析。这时同药倍半关系浓度就是藻响应药品的敏感浓度，可进行联合作用测试时药液配制的参照浓度分析。

图2 二元联合作用的测试杯布局Fig. 2 Arrangement of cups in binary combined effect test

测试杯布局见图2，藻温测试方法见1.2。相加作用分析可采用软件分析，将测试藻温输入软件AICEAS，分析相加作用。也可采用人工分析，将测试藻温用1.3.2、1.3.3方法分析各浓度的藻响应温差，再用1.4.3的方法，找出联合药液的最大藻响应温差、单药药液的藻响应温差，进行联合作用指数θ计算，根据联合作用评价方法(1.4.2)分析相加作用。如果分析结果为相加作用，即可进行参照浓度分析。

参照浓度确定的原则为在测试的2种药品中，以毒性大的药品的同药倍半关系浓度的倍浓度、半浓度作为联合药液、单药液配制的参照浓度。联合药液[A+B]=单药液[A]+单药液[B]，其中，单药液[A]=单药液[B]。参照浓度确定的方法为比较2种药品的同药倍半关系浓度，找出其浓度小药品(即毒性大的药品)，以其倍浓度、半浓度作为测试用的联合药液、单药液配制的参照浓度。比如，测试同药倍半关系浓度(g·L-1)时，A为4:2，B为2:1，B小于A，即B毒性大于A，根据参照浓度确定原则，以B的同药倍半关系浓度作为测试药液配制的参照浓度，联合药液浓度:单药液的参照浓度为2:1。

1.5.2 联合作用测试

(1) 药液配制

按参照浓度确定的原则和方法配制测试药液的浓度(1.5.1(1))。

(2) 藻温测试

测试杯布局见图2；藻温测试方法见1.2。

(3) 藻温分析

软件分析：将测试藻温输入软件AICEAS，进行联合作用类型分析。

人工分析：将测试藻温用1.3.2、1.3.3方法分析各浓度的藻响应温差，再用1.4.3的方法，找出联合药液的最大藻响应温差、单药药液的藻响应温差，进行联合作用指数θ计算。

1.5.3 联合作用测试

根据联合作用评价方法(1.4.2)分析联合作用类型。

1.5.4 测试结果的重现性分析

首次联合作用测试完成后，再进行2次相同测试，以有重现性的联合作用类型作为最终测试结果。

2 结果(Results)

2.1 参照浓度分析结果

2.1.1 藻响应的重金属浓度梯度

由表1可知，藻响应的重金属浓度(g·L-1)梯度中Cu(Ⅱ)、Mn(Ⅱ)、Hg(Ⅱ)、Cd(Ⅱ)和Pb(Ⅱ)均为8、4、2、1、0.5、0.25；Fe(Ⅲ)为8、4、2、1；Al(Ⅲ)为8、1、0.5、0.25；Cr(Ⅲ)为8、4、2、0.25；Zn(Ⅱ)为8、4、2、0.5、0.25。

2.1.2 初步分析的同药(重金属)倍半关系浓度

由表2可知，初步分析的同药倍半关系浓度(g·L-1)中，Cd(Ⅱ)、Cr(Ⅲ)、Fe(Ⅲ)、Pb(Ⅱ)、Zn(Ⅱ)为2:1，Al(Ⅲ)、Mn(Ⅱ)为1:0.5，Cu(Ⅱ)、Hg(Ⅱ)为0.5:0.25。

2.1.3 同药倍半关系浓度的验证分析

由表3可知，同药倍半关系浓度初步分析结果的再现性测试中，8种首测结果为相加作用的都具有再现性，首测结果相加作用的出现率为89%，表明首测结果的可信性高。1种首测结果为拮抗作用的没有再现性，但最终结果为相加作用，且具有重现性。

表1 藻响应重金属的测试结果Table 1 Test results of algae response to heavy metals

注：藻对药液有响应用“+”表示，藻对药液无响应用“-”表示。测试藻为滇池铜绿微囊藻，藻密度≥3.14×109个·L-1，环境温度为17.5 ℃～25.4 ℃。

Note： “+”, algae responds to liquid, “-”, algae didn’t respond to liquid; algae in test isMicrocystisaeruginosain Dianchi Lake in China; algal density is no less than 3.14×109cells·L-1；environmental temperature is between 17.5 ℃ and 25.4 ℃.

表2 同药倍半关系浓度初步分析结果Table 2 Preliminary analysis results of concentration relation for the same medicine

注：有相加作用为“+”，无相加作用为“-”。测试藻为滇池铜绿微囊藻；藻密度≥3.14×109个·L-1；环境温度为17.5 ℃～25.4 ℃。

Note： Additive effect is "+", no additive effect is "-"; algae in test isMicrocystisaeruginosain Dianchi Lake in China; algal density is no less than 3.14×109cells·L-1; environmental temperature is between 17.5 ℃ and 25.4 ℃.

通过再现性分析的同药倍半关系浓度(g·L-1)中，Cd(Ⅱ)、Cr(Ⅲ)、Fe(Ⅲ)、Pb(Ⅱ)、Zn(Ⅱ)均为2:1；Al(Ⅲ)、Mn(Ⅱ)为1:0.5，Cu(Ⅱ)、Hg(Ⅱ)为0.5:0.25。根据敏感浓度定义，这些重金属倍半关系浓度就是藻响应的敏感浓度。

2.1.4 药液配制的参照浓度

由表4可知：①联合药液参照浓度:单药液参照浓度=0.5:0.25(g·L-1)的二元组合是：Cu2++Fe3+、Cu2++Mn2+、Cu2++Hg2+、Cu2++Cd2+、Cu2++Pb2+、Cu2++Zn2+、Fe3++Hg2+、Mn2++Hg2+、Al3++Hg2+、Cr3++Hg2+、Cu2++Al3+、Cu2++Cr3+、Hg2++Cd2+、Hg2++Pb2+、Hg2++Zn2+。②联合药液参照浓度:单药液参照浓度=2.0:1.0(g·L-1)的二元组合是： Cr3++Cd2+、Cd2++Zn2+、Pb2++Zn2+、Cr3++Pb2+、Fe3++Cd2+、Fe3++Cr3+、Fe3++Pb2+、Fe3++Zn2+、Cr3++Zn2+、Cd2++Pb2+。③联合药液参照浓度:单药液参照浓度=1.0:0.5(g·L-1)的二元组合是：Fe3++Mn2+、Fe3++Al3+、Mn2++Cd2+、Al3++Cr3+、Al3++Cd2+、Al3++Pb2+、Al3++Zn2+、Mn2++Al3+、Mn2++Cr3+、Mn2++Pb2+、Mn2++Zn2+。

2.2 同药倍半关系浓度的再现性和重现性

由表3可知，在9种重金属的同药倍半关系浓度分析中8种重金属的首测结果为相加作用，其中6种首测结果的再现性为100%，另2种再现性为50%，全部首测结果再现性的出现率为89%；9种相加作用结果中，6种的重现性为100%，3种的重现性为67%；9种相加作用结果重现性的出现率为100%。分析表明，二元联合作用藻红外测试方法的测试效果较好。

表3 同药倍半关系浓度的再现性分析结果Table 3 Reproducibility analysis results of concentration relation for the same medicine

注：测试藻为滇池铜绿微囊藻；藻密度≥3.14×109个·L-1；环境温度为17.5 ℃～25.4 ℃。

Note： algae in test isMicrocystisaeruginosain Dianchi Lake in China; algal density is no less than 3.14×109cells·L-1; environmental temperature is between 17.5 ℃ and 25.4 ℃.

表4 重金属二元联合作用藻红外测试分析结果Table 4 Analysis results of binary combined effects of heavy metals in algae infrared test

续表联合作用测试药液Jointactiontestsolution第1次实验Firstexperiment第2次实验Secondexperiment第3次实验Thirdexperiment二元组合Binarycombination参照浓度[两药]:[单药]/(g·L-1)ReferenceconcentrationTwodrugs:Onedrug/(g·L-1)指数Index(θ)类型Type指数Index(θ)类型Type指数Index(θ)类型Type再现率Reappearancerate重现率Recurrencerate结果Result再现性的出现率Occurrencerateofreappearance重现性的出现率Occurrencerateofrecurrence总再现性出现率Totalrateofreappearance总重现性出现率TotalrateofrecurrenceCr3+,Pb2+2.0:1.00.51独立Indepedent1.60协同Synergism1.90协同Synergism0%67%协同SynergismCu2+,Al3+0.5:0.251.09相加Additive0.34拮抗Antagonism0.09拮抗Antagonism0%67%拮抗AntagonismCu2+,Cr3+0.5:0.250.56拮抗Antagonism0.54拮抗Antagonism1.54协同Synergism50%67%拮抗AntagonismFe3+,Cr3+2.0:1.00.09拮抗Antagonism0.56拮抗Antagonism1.67协同Synergism50%67%拮抗AntagonismFe3+,Pb2+2.0:1.00.39拮抗Antagonism0.56拮抗Antagonism1.65协同Synergism50%67%拮抗AntagonismFe3+,Zn2+2.0:1.00.08拮抗Antagonism0.43拮抗Antagonism0.15拮抗Antagonism100%100%拮抗AntagonismMn2+,Al3+1.0:0.50.49拮抗Antagonism0.93相加Additive0.55拮抗Antagonism50%67%拮抗AntagonismMn2+,Cr3+1.0:0.50.57拮抗Antagonism0.28拮抗Antagonism1.60协同Synergism50%67%拮抗AntagonismMn2+,Pb2+1.0:0.50.35拮抗Antagonism1.06相加Additive0.36拮抗Antagonism50%67%拮抗AntagonismMn2+,Zn2+1.0:0.50.50拮抗Antagonism1.42相加Additive0.37拮抗Antagonism50%67%拮抗AntagonismCr3+,Zn2+2.0:1.00.42拮抗Antagonism0.56拮抗Antagonism0.35拮抗Antagonism100%100%拮抗AntagonismHg2+,Cd2+0.5:0.250.40拮抗Antagonism0.25拮抗Antagonism1.43协同Synergism50%67%拮抗AntagonismHg2+,Pb2+0.5:0.250.27拮抗Antagonism0.50拮抗Antagonism0.66相加Additive50%67%拮抗AntagonismHg2+,Zn2+0.5:0.250.37拮抗Antagonism0.33拮抗Antagonism0.54拮抗Antagonism100%100%拮抗AntagonismCd2+,Pb2+2.0:1.00.49拮抗Antagonism0.30拮抗Antagonism0.90相加Additive50%67%拮抗Antagonism0100%93%100%

注：测试藻为滇池铜绿微囊藻；藻密度≥3.14×109个·L-1；环境温度为17.5 ℃～25.4 ℃。

Note： algae in test isMicrocystisaeruginosain Dianchi Lake in China; algal density is no less than 3.14×109cells·L-1; environmental temperature is between 17.5 ℃ and 25.4 ℃.

2.3 测试结果的多样性、再现性、重现性

由表5可知，在36组的联合作用测试结果中，出现拮抗、相加、协同3种联合作用类型，测试结果出现多样性；14组拮抗作用中单组的再现性为50%～100%、多组的再现性的出现率为93%，单组的重现性为67%～100%、多组的重现性的出现率为100%，21组相加作用中单组的再现性为50%～100%、多组的再现性的出现率为86%，单组的重现性为67%～100%、多组的重现性的出现率为100%，1组协同作用的重现性为100%、重现性的出现率为100%；36组联合作用测试结果的再现性为50%～100%、再现性的出现率为86%，重现性为67%～100%、重现性的出现率为100%。分析表明，二元联合作用藻红外测试方法的测试效果良好。

3 讨论(Discussion)

3.1 测试结果的再现性与重现性

在同药倍半关系浓度测试中(2.2)，相加作用结果的再现性、再现性的重现率和重现性、重现性的重现率都比较好。在联合作用测试结果中出现的相加、拮抗、协同的联合作用类型，每一种类型的再现性、再现性的重现率和重现性、重现性的重现率都比较好(2.3)。藻红外测试技术有较好的测试效果，并细化了测试条件，改进了藻温测试方法，提出了三指标评价法和参照浓度分析方法，修正了联合作用偏差f值的结果。这样，改进后的藻温测试方法、三指标评价方法、重现性分析能够保证藻响应温差和藻响应药品评价结果的质量，参照浓度分析方法、二元联合作用评价方法、重现性分析能够控制联合作用分析结果的质量。

3.2 测试结果的多样性

在联合作用测试结果中出现了相加、拮抗、协同3种联合作用类型，占4种联合作用的75%，表现出一定的多样性。当有多种联合作用类型出现时，并且每一种类型具有较好的再现性、重现性，表明联合作用评价法的f值=0.42是恰当的。当测试结果没有多样性时，表明f值过小或过大。

3.3 参照浓度及其分析方法的意义

联合作用分析需要定量测出药品参照浓度(敏感浓度)引起的藻响应温差。因此，测试联合作用最为关键的是药液配制的标准，而参照浓度就是药液配制的标准和依据，没有参照浓度联合作用测试便无可控性，也就没有可信的测试结果，参照浓度在联合作用测试中非常重要，因此它是联合作用测试的关键技术。由于藻响应的有毒有害物都存在敏感浓度，那么，用参照浓度分析方法就可找出不同有毒有害物的参照浓度，因此藻红外测试技术可用于测试重金属、农药、有机化学药品、抗生素等的二元联合作用。

3.4 软件开发的必要性

在测试1组二元联合作用时，配制药液的参照浓度测试、联合作用测试、重现性分析测试中，测试的藻温数据巨大，而且不同数据需要专门分析，因此采用软件处理即可提高分析速度又可避免人工分析易出现的差错，因此数据处理软件是二元联合作用藻红外测试技术的重要组成部分。

综上分析，二元联合作用测试结果具有较好的多样性、再现性、重现性，这是由于测试条件、藻温测试方法、藻响应温差评价方法能够保证藻响应温差的质量，参照浓度分析方法、联合作用评价方法、重现性分析等能够控制联合作用测试结果的质量。藻红外技术测试重金属二元联合作用是可行的。参照浓度作为药液配制的标准是可行的，在联合作用分析中不可或缺。藻响应的有毒有害物都存在敏感浓度，用参照浓度分析方法可分析出藻响应有毒有害物的参照浓度，因此，藻红外测试技术可用于测试重金属、农药、有机化学药品、抗生素等的二元联合作用。联合作用藻红外测试中，用AITAS软件、AITHCAS软件、AICEAS软件将大大提高数据处理分析的效率。

[1] Beyer J, Jonsson G, Porte C, et al. Analytical methods for determining metabolites of polycyclic aromatic hydrocarbon (PAH) pollutants in fish bile: A review [J]. Environmental Toxicology and Pharmacology, 2010, 30(3): 224-244

[2] 杨蓉, 李娜, 饶凯锋, 等. 环境混合物的联合毒性研究方法[J]. 生态毒理学报, 2016, 11(1): 1-13

Yang R, Li N, Rao K F, et al. Review on methodology for environmental mixture toxicity study [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2016, 11(1): 1-13 (in Chinese)

[3] 孔繁翔. 环境生物学[M]. 北京: 高等教育出版社, 2000: 92-93

Kong F X. Environmental Biology [M]. Beijing: Higher Education Press, 2000: 92-93 (in Chinese)

[4] 徐小惠, 段莉丽, 崔建升. 铜绿微囊藻叶绿素荧光对HgCl2毒性响应特性的研究[J]. 河北科技大学学报, 2013, 34(5): 477-481

Xu X H, Duan L L, Cui J S. Study on the characteristics ofMicrocystisaeruginosachlorophyll fluorescence responding on the toxicity of HgCl2[J]. Journal of Hebei University of Science and Technology, 2013, 34(5): 477-481 (in Chinese)

[5] 郭蔚华, 周美修, 范建元, 等. 星肋小环藻、滇池铜绿微囊藻的春化作用[J]. 生态环境学报, 2014, 23(7): 1187-1192

Guo W H, Zhou M X, Fan J Y, et al. Verenalization inCyclotellaasterocostataandMicrocystisaeruginosa[J]. Ecology and Environmental Sciences, 2014, 23(7): 1187-1192 (in Chinese)

[6] 郭蔚华, 余敏, 刘青香, 等. 滇池铜绿微囊藻春化过程与诱导低温间的关系[J]. 生态环境学报, 2015, 24(12): 2022-2026

Guo W H, Yu M, Liu Q X, et al. Vernalization process and the relationship between inductive low temperature inMicrocystisaeruginosain Dianchi Lake [J]. Ecology and Environmental Sciences, 2015, 24(12): 2022-2026 (in Chinese)

[7] Nishiyama Y, Yamamoto H, Allakhverdiev S I, et al. Oxidative stress inhibits the repair of photodamage to the photosynthetic machinery [J]. EMBO Journal, 2001, 20(20): 5587-5594

[8] 聂剑初, 吴国利, 张翼伸, 等. 生物化学简明教程[M]. 北京: 高等教育出版社, 1994: 30-31

Nie J C, Wu G L, Zhang Y S, et al. Essential Biochemistry [M]. Beijing: Higher Education Press, 1994: 30-31 (in Chinese)

[9] 孔繁翔, 陈颖, 章敏. 镍、锌、铝对羊角月牙藻生长及酶活性影响研究[J]. 环境科学学报, 1997, 17(2): 193-197

Kong F X, Chen Y, Zhang M. Effects of nickel, zinc and aluminum on the growth and enzyme activities of green algaSelenastrumcapricornutum[J]. Acta Science Circumstantiae, 1997, 17(2): 193-197 (in Chinese)

[10] Ouyang H L, Kong X Z, Lavoie M, et al. Photosynthetic and cellular toxicity of cadmium inChlorellavulgaris[J]. Environmental Toxicology and Chemistry, 2013, 32(12): 2762-2770

[11] Andosch A, Affenzeller M J, Lütz C, et al. A freshwater green alga under cadmium stress: Ameliorating calcium effects on ultrastructure and photosynthesis in the unicellular modelMicrasterias[J]. Journal of Plant Physiology, 2012, 169(15): 1489-1500

[12] 张纯伟, 刘双. 重金属对植物光合作用的影响研究进展[J]. 成功: 教育版, 2007(9): 171-173

Zhang C W, Liu S. Research progress on effects of heavy metals on plant photosynthesis [J]. Success: Education Edition, 2007(9): 171-173 (in Chinese)

[13] Mohapatra P K, Schubert H, Schiewer U. Effect of dimtheate on photosynthesis and pigment fluorescence ofSynechocystissp PCC6803 [J]. Ecotoxicology and Environmental Safety, 1997, 36: 231-237

[14] Mattoo H K, St John J B, Wergin W P, et al. Adaptive reoganization of protein and lipid components in chloroplast members as associated with herbicide binding [J]. Journal of Cellular Biochemistry, 1984, 24: 145-163

[15] 韩博平, 韩志国, 付翔. 藻类光合作用机理与模型[M]. 北京: 科学出版社, 2003: 43-44

Han B P, Han Z G, Fu X. Photosynthetic Mechanism and Model of Algae [M]. Beijing: Science Press, 2003: 43-44 (in Chinese)

[16] 刘滨扬. 红霉素、环丙沙星、磺胺甲噁唑对羊角月牙藻的毒性效应及其作用机理[D]. 广州: 暨南大学, 2011: 7

Liu B Y. Toxic effects and its mechanism of erythromycin ciprofloxacin and sulfamethoxazole toSelenastrumcapricornutum[D]. Guangzhou: Jinan University, 2011: 7 (in Chinese)

[17] 李慧. 呼吸链复合体II和复合体III抑制剂的筛选及动力学研究[D]. 武汉: 华中师范大学, 2012: 46

Li H. Studies on discovery and kinetics inhibition of complex II and complex III inhibitors [D]. Wuhan: Central China Normal University, 2012: 46 (in Chinese)

[18] 倪妍. 硝磺草酮对微囊藻和四尾栅藻的毒性效应及致毒机理研究[D]. 南昌: 南昌大学, 2014: 16

Ni Y. Toxic effects and mechanisms of mesotrione onMicrocystissp. andScenedesmusquadricauda[D]. Nanchang: Nanchang University, 2014: 16 (in Chinese)

[19] 郭蔚华, 苏海燕, 张智, 等. 藻红外辐射测试环境重金属急性毒性[J]. 生态环境, 2008, 17(2): 520-523

Guo W H, Su H Y, Zhang Z, et al. The research of algae infrared radiation for acute toxicity test of heavy metals [J]. Ecology and Environment Sciences, 2008, 17(2): 520-523 (in Chinese)

[20] 郭蔚华, 王翔, 张智, 等. 藻红外辐射测试环境农药残留急性毒性研究[J]. 农业环境科学学报, 2008, 27(5): 2039-2042

Guo W H, Wang X, Zhang Z, et al. Determination of the acute toxicity of pesticide residues in environment by algae infrared radiation [J]. Journal of Agro-Environment Science, 2008, 27(5): 2039-2042 (in Chinese)

[21] 郭蔚华, 丁燕燕, 张智, 等. 有机毒害物急性毒性与藻红外辐射变化研究[J]. 环境科学与技术, 2009, 32(7): 35-37

Guo W H, Ding Y Y, Zhang Z, et al. Relationship between acute toxicity of poisonous organic matters and change of algae infrared radiation [J]. Environmental Science and Technology, 2009, 32(7): 35-37 (in Chinese)

[22] 成丽芸. 急性毒性藻红外测试中抗生素的敏感藻确定[D]. 重庆: 重庆大学, 2010: 19

Cheng L Y. Research on the determining sensitive algae in measuring algae infrared radiation to respond to acute toxicity of antibiotics [D]. Chongqing: Chongqing University, 2010: 19 (in Chinese)

[23] Liu S S, Wang C L, Zhang J, et al. Combined toxicity of pesticide mixtures on green algae and photobacteria [J]. Ecotoxicology and Environmental Safety, 2013, 95(1): 98-103

[24] Kahru A, Tomson K, Pall T, et al. Study of toxicity of pesticides using luminescent bacteriaPhotobacteriumphosphoreum[J]. Water Science and Technology, 1996, 33(6): 147-154

[26] Zhu X W, Liu S S, Ge H L, et al. Comparison between the short-term and the long-term toxicity of six triazine herbicides on photobacteria Q67 [J]. Water Research, 2009, 43(6): 1731-1739

[27] Zhang Y H, Liu S S, Song X Q, et al. Prediction for the mixture toxicity of six organophosphorus pesticides to the luminescent bacterium Q67[J]. Ecotoxicology and Environmental Safety, 2008, 71(3): 880-888

[28] 方战强, 陈中豪, 胡勇有, 等. 发光细菌法在水质监测中的应用[J]. 重庆环境科学, 2003, 25(2): 56-58

Fang Z Q, Chen Z H, Hu Y Y, et al. Application of photobacterium toxicity test method for phosphoreum water quality monitoring [J]. Chongqing Environmental Sciences, 2003, 25(2): 56-58 (in Chinese)

[29] 韦东普, 马义兵, 陈世宝, 等. 发光细菌法测定环境中金属毒性的研究进展[J]. 生态学杂志, 2008, 27(8): 1413-1421

Wei D P, Ma Y B, Chen S B, et al. Assessment of metals toxicity in environment by using bioluminescent bacteria bioassay: A review [J]. Chinese Journal Ecology, 2008, 27(8): 1413-1421 (in Chinese)

[30] 郭蔚华, 周伟, 成丽芸, 等. 急性毒性藻红外测试中联合作用的评价方法[J]. 生态毒理学报, 2010, 5(3): 382-387

Guo W H, Zhou W, Cheng L Y, et al. Evaluation method for combined toxicity effects in the measure of alage infrared radiation for acute toxicity [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2010, 5(3): 382-387 (in Chinese)

[31] 郭蔚华, 马金龙, 吴玉龙. 藻红外测试多元有机毒物急性毒性的初步分析[J]. 生态环境学报, 2010, 19(11): 2733-2736

Guo W H, Ma J L, Wu Y L. Preliminary analysis on the acute toxicity of multiple poisonous organic matters in measuring algae infrared radiation [J]. Ecology and Environment Sciences, 2010, 19(11): 2733-2736 (in Chinese)

[32] 郭蔚华, 钱建伟, 吴玉龙, 等. 急性毒性藻红外测试中联合作用评价法的重现性[J]. 生态毒理学报, 2014, 9(1): 174-179

Guo W H, Qian J W, Wu Y L, et al. Study on reproducibility of evaluation method for combined effects in the measure of algae infrared radiation for acute toxicity [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2014, 9(1): 174-179 (in Chinese)

[33] 郭蔚华, 李星广, 林艳, 等. 化学品急性毒性藻红外测试技术改进方法研究[J]. 生态毒理学报, 2016, 11(6): 330-337

Guo W H, Li X G, Lin Y, et al. Improving methods for algae infrared radiation technology of testing chemicals acute toxicity [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2016, 11(6): 330-337 (in Chinese)