培哚普利改善心室重构作用与Gal-3的相关性

张跃华，李树仁，邓文浩，杨玲玲，郝 潇，李 沙

(河北医科大学研究生学院/河北省人民医院心内一科，石家庄 050051)

心力衰竭是一种复杂的临床征候群，是各种心血管疾病的严重阶段，而心室重构被认为是心力衰竭发展的基础[1]。已有众多基础和临床研究表明，心室重构在心力衰竭的发生、发展中起着关键作用[2-4]。近年来，减慢或延缓心室重构的进展成为治疗心力衰竭的主要方向。目前半乳糖凝集素-3(Galectin-3，Gal-3)与心力衰竭和心室重构的关系备受关注。近期研究表明Gal-3促进心肌纤维化、参与心肌炎性改变和心室重塑等过程[5]。所以Gal-3有可能作为一种新型的心力衰竭指标，运用在心力衰竭的诊断和预后方面，而抑制Gal-3的表达和作用也将成为治疗心力衰竭的一个新方向。然而血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)作为心力衰竭的治疗的基石，可以改善心室重构，但其机制还不完全清楚，ACEI改善缺血性心力衰竭家兔心室重构作用是否与Gal-3的表达相关尚不明确。本研究通过应用培哚普利治疗心肌梗死后心功能障碍家兔，检测家兔心肌组织中Gal-3、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原的 mRNA 和蛋白的表达、血清Gal-3水平和心功能的变化，观察应用培哚普利治疗和未应用培哚普利治疗对Gal-3的水平、心功能的影响，探讨可能机制。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物 本实验选用健康 3 月龄新西兰雄性家兔(合格证号：1606173)30只，每只体质量约2.5 kg，由河北医科大学实验动物中心提供。

1.1.2试验与仪器 培哚普利片(雅施达制药有限公司，中国)；注射用青霉素钠 (华北制药，中国)；兔血清Galectin-3 ELISA试剂盒(上海蓝基科技公司，中国)；HiFi-MMLV cDNA第一链合成试剂盒(CWbio.Co.Ltd，中国)、UltraSYBR Mixture(CWbio.Co.Ltd，中国)、5 RNA上样缓冲(CWbio.Co.Ltd，中国)。心脏超声仪(TOSHIBA，日本)；低速台式离心机(上海安亭科学仪器厂，中国)；涡旋振荡仪QL-902(海门市其林贝尔仪器制造有限公司，中国)；分光光度计NANODROP 2000(Thermo scientific，美国)；荧光定量PCR仪Line Gene 9600 Plus(Bioer Technology，中国)；双垂直电泳槽(CAVOY MP-8001，中国)；转移槽(CAVOY MP-3030，中国)；温控摇床(其林贝尔TS-2000A，中国)；电泳仪(CAVOY PP-1150，中国)。

1.2方法

1.2.1分组及处理 30只家兔分为假手术组、心力衰竭组和培哚普利组，每组10只，分别检测术后2周左室射血分数(LVEF)，LVEF<50%为模型制作成功。模型制作成功后假手术组和心力衰竭组均以2 mL·kg-1·d-1的生理盐水灌胃4 周，培哚普利组以2 mL·kg-1·d-1的培哚普利(药物的浓度为0.33 mg/mL) 灌胃4 周。

1.2.2动物模型制备 采用结扎前降支的方法制作心功能障碍模型。记录术前心电图后开胸结扎冠状动脉前降支，模型制备成功标准为心尖部及左室前壁由红色变为暗紫色，局部心肌运动异常，心电图示胸前导联 ST 段持续弓背向上抬高[6]。假手术组只开胸不结扎冠状动脉前降支，模型制备后心尖部及左室前壁无颜色变化，心肌运动无异常，心电图示胸前导联 ST 段未抬高。两组术后 3 d每天青霉素 80 万单位肌内注射。

1.2.3心功能检测 术前、术后2周及4周由同一人行超声心动图检查，测量两组LVEF、左室舒张末期内径(end diastolic diameter，EDD)。所有测量值均取3 次测量的平均值。

1.2.4梗死区心肌组织中Gal-3、Ⅰ型胶原及Ⅲ型胶原的mRNA的表达的检测 给药4 周后，取心肌梗死区域心肌组织进行研磨，提取总RNA，琼脂糖凝胶电泳测其完整性;按照反转录试剂盒说明书进行反转录，反应条件为:42 ℃ 50 min，95 ℃ 5 min。Actin 上游引物5′-AGA TCG TGC GGG ACA TCA AG-3′,下游引物5′-CAG GAA GGA GGG CTG GAA GA-3′，扩增产物为182 bp；Ⅰ型胶原的上游引物为5′-TGA GCC AGC AGA TTG AGA ACA T-3′，下游引物为5′-TGT CGC AGA AGA CCT TGA TGG-3′，扩增产物为165 bp;Ⅲ型胶原 的上游引物5′-GTA CAA CTA GCA TTC CTC CGA CTG-3′，下游引物为5′-TTA GAG CAG CCA TCC TCC AGA AC-3′，扩增产物为203 bp;Gal-3的上游引物为5′-CTG TGC CTT ATG ACC TGC CTC T-3′，下游引物为5′-TCA TTG ACC GCA ACC TTG AAG TG-3′，扩增产物为301 bp。将获得的cDNA 按照实时荧光定量PCR 试剂盒操作说明书方法扩增目的基因，PCR 热循环参数为96 ℃ 4 min，然后3 步反应:95 ℃10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，45个循环。以Actin为内参照，将目的基因表达的相对定量值用于统计学分析。PCR采用2-ΔΔCt(ΔCt=目的基因Ct值-Actin Ct值，ΔΔCt = 目的基因ΔCt 值- 内参照基因ΔCt 值) 法计算结果[7]。将所得的Gal-3 mRNA表达量与LVEF 进行相关性分析。

1.2.5梗死区心肌组织中Gal-3、Ⅰ型胶原及Ⅲ型胶原的检测 将梗死区的心肌组织称重后研磨提取组织中的蛋白，根据目的蛋白的分子量，配制8%、12%的分离胶，5%浓缩胶，进行丙烯酰胺凝胶电泳，然后湿转膜，最后用Western blot 试剂盒显色、ECL发光反应检测并分析目的蛋白。将所得的Gal-3蛋白水平与LVEF 进行相关性分析。

1.2.6血清中Gal-3的检测 分别在术前、术后2、4周，经家兔耳中动脉取血，离心15 min 后取上清液，按照ELISA 试剂盒说明书进行操作;依据标准品浓度及其A值计算相应公式;依据公式和样品A值计算标本Gal-3的浓度，然后将所得的血清Gal-3 的浓度与LVEF 进行相关性分析。

2 结 果

2.1造模结果 30只新西兰雄性家兔在造模术后共有24 只存活。假手术组存活8只，死亡2只，其中1只于手术过程中大出血死亡，另1只开胸过程中发生气胸而死亡。心力衰竭组存活 8只，死亡2只,2只于结扎前降支的过程中诱发室颤而死亡。培哚普利组存活8只，死亡2只，1只于开胸过程中发生气胸而死亡，另1只于结扎前降支的过程中诱发室颤而死亡。

2.2心功能检查结果 对术前3组的超声结果行单因素方差分析，结果显示LVEF差异无统计学意义(P>0.05)。与假手术组相比，术后2周心力衰竭组和培哚普利组的LVEF明显减小(P<0.05),术后4周培哚普利组较心力衰竭组的LVEF上升(P<0.05)，见表1、图2。

图2 各组术后4周的超声心动图

2.3梗死区心肌组织Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原及Gal-3的mRNA的表达 与假手术组相比，心力衰竭组与培哚普利组梗死区心肌组织Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原及Gal-3的mRNA的表达明显增加(P<0.05)，培哚普利组较心力衰竭组梗死区心肌组织Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原及Gal-3的mRNA的表达减少(P<0.05)。相关性分析显示Gal-3与LVEF呈负相关(r=-0.912，P<0.05)，见表2。

表1 各组间术前、术后2、4周后LVEF的比较

a：P<0.05,与假手术组比较；b：P<0.05,与心力衰竭组比较

表2 梗死区心肌组织Gal-3、Ⅰ型胶原及Ⅲ型胶原mRNA表达的比较

a：P<0.05,与假手术组比较；b：P<0.05,与心力衰竭组比较

2.4梗死区心肌组织Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原及Gal-3的蛋白水平 Western blot的检测结果表明,与假手术组相比，心力衰竭组和培哚普利组梗死区心肌组织中Gal-3、Ⅰ型胶原及Ⅲ型胶原的蛋白水平增加(P<0.05)，培哚普利组较心力衰竭组Gal-3、Ⅰ型胶原及Ⅲ型胶原的蛋白水平减少(P<0.05)。相关性分析显示Gal-3与LVEF呈负相关(r=-0.809，P<0.05)，见表3，图3。

表3 梗死区心肌组织Gal-3、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原蛋白水平比较

a：P<0.05,与假手术组比较；b：P<0.05,与心力衰竭组比较

图3 梗死区心肌组织Gal-3、Ⅰ型胶原及Ⅲ型胶原Western-blob的检测结果

2.5血清Gal-3水平 3组术前血清中Gal-3的水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)。术后4周培哚普利组血清Gal-3水平较心力衰竭组下降(P<0.05)，与假手术组比较，差异无统计学意义(P<0.05)。相关性分析显示，Gal-3与LVEF呈负相关(r=-0.925，P<0.05)，见表4。

表4 各组间术前、术后2、4周Gal-3的浓度比较

a：P<0.05,与假手术组比较；b：P<0.05,与心力衰竭组比较

3 讨 论

1989年BAUMBACH等[8]提出心室重构这个概念。心室重构被认为是心力衰竭发展的基础，是心力衰竭患者发病率和死亡率的决定因素，所以减慢或延缓心室重构的进展成为治疗心力衰竭的主要方向。然而ACEI作为心力衰竭的治疗基石，其在逆转心室重构和心肌纤维化的作用越来越受关注。近几年的研究表明ACEI逆转心室重构的作用机制除了抑制血管紧张素Ⅱ生成外，还可增加前列腺素的合成、抑制缓激肽的降解等，但其抑制心肌纤维化的研究尚少，机制不完全明确。近期已有研究表明，Gal-3在众多心血管疾病中也起着重要作用[9-12]，其参与心肌纤维化，促进了心室重构和心力衰竭的发展。同时期也有研究表明Gal-3可能是抗心室重构治疗的一个靶点[13-15]。

纵观国内外研究发现，RASS系统与Gal-3之间关系研究较为少见。本研究检测结果进行分析发现，培哚普利组与心力衰竭组比较，心肌组织中的纤维蛋白明显减少，与此同时Gal-3的表达也明显减少。由此可见培哚普利改善心肌纤维化很可能与Gal-3的表达减少有关。Gal-3 mRNA表达水平、Gal-3蛋白水平都与LVEF存在负相关，这就表明随着Gal-3水平的下降心功能在逐渐升高。这也反映培哚普利改善心功能很有可能与Gal-3水平降低有关。由此可见培哚普利在抑制心肌纤维化、减缓心室重构过程中与Gal-3的表达存在很大相关性。

本研究通过应用培哚普利治疗心肌梗死后心功能障碍家兔，改善缺血性心力衰竭家兔的心功能，验证了培哚普利减少Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原表达，抑制心肌纤维化，减缓心室重构过程与Gal-3的表达存在很大相关性。Gal-3很可能是培哚普利改善心室重构作用的一个新的治疗靶点，值得进一步研究。

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