车前草幼苗中黄酮类物质提取工艺

李 蒙

(西安文理学院 生物与环境工程学院，西安 710065)

车前草(Plantagoasiatica L.)属车前科车前属多年生矮生草本植物，在自然界中分布广泛，生长于温暖、潮润、向阳的山野或路旁等处，民间采集幼嫩苗经加工成美味佳肴，而食用后能调节胃肠功能，治疗小便不利、痰热咳喘等多种疾病[1-2]，这是由于车前草不同组织中含有多种生物活性的黄酮类物质所起的疗效[3-4].因此，具有药食两用的车前草被人们开发利用，是重要的中草药资源，具有广阔的市场前景.鉴此，本研究以车前草幼嫩苗作为实验材料，乙醇溶剂提取，优化提取工艺，以期为车前草资源利用提供支持.

1 材料与方法

1.1 材料

试验采摘陕西省商洛市商州区黑龙口镇山野中车前草种子，种植于西安文理学院植物繁育单元的温室中，一个月内，采摘其幼苗作为研究对象；芦丁标准品由上海源叶生物科技提供.

1.2 仪器

全自动鼓风干燥箱(型号：ZFD-5250A，陕西天美)，紫外·可见分光光度计(型号：UV-2450，岛津公司)，电子天平(型号：BSA223S，上海智泰电子科技)，恒温水浴锅(型号：HH-S，北京科伟)，台式高速大容量离心机(型号：5810R，艾本德).

1.3 实验方法

1.3.1 车前草幼苗预处理

将采摘幼苗清洗干净、沥干幼苗上的水分，置于恒温干燥培养箱中，在60 ℃干燥至恒重，叶片通过研磨粉碎，过60目筛，密封保存4 ℃.

1.3.2 乙醇提取车前草幼苗中黄酮类物质

称取2 g粉碎样品，加入石油醚脱脂与脱色，最后风干，然后在不同乙醇浓度、提取时间、温度、料液比的条件下热抽提取，12 000 r/min离心10 min，取上清液，摇匀定容至25 mL，即为黄酮类物质提取液.

1.3.3 车前草幼苗中黄酮类物质含量的测定

取5 mL提取液于25 mL容量瓶中，加入0.75 mL的5% NaNO3溶液，混匀后，加入0.75 mL的10% Al(NO3)3溶液，10 min后加入10 mL的1 mol/L NaOH溶液，再 30%乙醇定容，室温放置10 min，然后510 nm分光光度计测定吸光值，测定提取液中黄酮含量.测定以芦丁为对照的硝酸化铝法.

以芦丁为对照品的标准曲线的绘制：称取2.0 mg芦丁标准品溶解于60%乙醇中，定容于20 mL棕色容量瓶中，配制成浓度为0.1 mg/mL的芦丁标准溶液.吸取0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL芦丁标准溶液，分别置于25 mL容量瓶中，各加入0.75 mL的5% NaNO3溶液，混匀后加入0.75 mL的10% Al(NO3)3溶液，室温放置10 min，加入10.0 mL的1 mol/L NaOH溶液.30%乙醇定容至刻度，摇匀静置10 min.在510 nm处测定不同浓度芦丁混合溶液吸光值，绘制吸光度X与芦丁含量Y(mg/mL)标准曲线为Y=0.025X-0.000 1(R2=0.994)，计算总黄酮得率(提取的黄酮量/提取物质量).

1.4 不同因素对黄酮提取效率的影响

[5]对影响车前草幼苗中黄酮提取效果的因素(乙醇浓度、提取温度、提取时间和料液比)进行研究.

1.4.1 乙醇浓度对车前草幼苗中黄酮提取效果的影响

以40%、50%、60%、70%、80%不同浓度乙醇提取黄酮，在料液比为1∶30，温度70 ℃提取2 h，测定车前草幼苗中黄酮含量.

1.4.2 提取温度对车前草幼苗中黄酮提取效果的影响

以50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃不同温度提取黄酮，在料液比为1∶30，以70%乙醇提取2 h，测定车前草幼苗中黄酮含量.

1.4.3 提取时间对车前草幼苗中黄酮提取效果的影响

以0.5 h、1 h、1.5 h、2 h、3 h不同时间提取黄酮，在料液比为1∶30，温度70 ℃，以70%乙醇提取，测定车前草幼苗中黄酮含量.

1.4.4 料液比对车前草幼苗中黄酮提取效果的影响

分别以1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60的不同料液比，在70%乙醇浓度，温度70 ℃，提取2 h的条件下，测定车前草幼苗中黄酮含量.

2 结果与分析

2.1 乙醇浓度对车前草叶片黄酮提取效果的影响

乙醇提取车前草幼苗中黄酮类物质，不同浓度乙醇提取溶剂与总黄酮提取率呈现一定的变化规律(图1)，当乙醇浓度达到70%时，车前草幼苗中总黄酮类物质的提取效率最高.

2.2 提取温度对车前草幼苗中黄酮提取效果的影响

乙醇提取车前草幼苗中黄酮类物质时，不同提取温度与总黄酮提取率呈现一定的变化规律(图2)，当提取温度达到60～70 ℃时，车前草幼苗中总黄酮类物质的提取效率较高，其中70 ℃为最高.

图1 乙醇浓度对总黄酮提取率的影响

图2 提取温度对总黄酮提取率的影响

2.3 提取时间对车前草幼苗中黄酮提取效果的影响

乙醇提取车前草幼苗中黄酮类物质时，不同提取时间与总黄酮提取率呈现一定的变化规律(图3)，当提取时间达到2 h，车前草幼苗中总黄酮类物质的提取效率最高.

2.4 料液比对车前草幼苗黄酮提取效果的影响

乙醇提取车前草幼苗中黄酮类物质时，不同料液比与总黄酮提取率呈现一定的变化规律(图4)，当料液比为1∶30时，车前草幼苗中总黄酮类物质的提取效率最高.

图3 提取时间对总黄酮提取率的影响

图4 料液比对总黄酮提取率的影响

3 结论与讨论

研究不同因素对黄酮提取率的影响，结果发现受影响的主次顺序为：乙醇浓度>提取温度>料液比>提取时间，其中乙醇浓度为70%，提取温度为70℃，料液比为1∶30，提取时间为2 h，是单因素试验中最优水平.黄酮提取过程受多种环境因素的影响，为了要得到准确的实验结果，提取获得黄酮类物质后，应尽快测定，研究发现黄酮提取液稳定性会受到光照、温度、pH值、金属离子等影响[6].医药学领域中发现车前草总黄酮在治疗前列腺增生以及体内的抗氧化性方面具有重要的意义[7-8].

[参考文献]

[1] 邱丁莲，张跃康.车前草的资源利用及栽培技术[J].农业科技通讯，2016(11)：229-231.

[2] 耿放，孙虔，杨莉，等.车前子与车前草利尿作用研究[J].上海中医药杂志，2009，43(8)：72-74.

[3] 杨亚军，周秋贵，曾红，等.车前草化学成分及新生物活性研究进展[J].中成药，2011，33(10)：1771-1776.

[4] 夏道宗，刘杰尔，陈佩佩.车前草总黄酮清除自由基及对小鼠氧化损伤的保护作用[J].科技通报，2009，25(6)：792-796.

[5] 王琳.玉米须中黄酮类物质提取工艺[J].微量元素与健康研究，2014，31(6):55-56.

[6] 崔莹.铁凉伞黄酮提取液稳定性研究[J].陕西农业科学，2017，63(3)：40-42.

[7] 张语迟，李赛男，刘春明，等.车前草多酚类化合物的提取工艺优化及抗氧化活性评价[J].时珍国医国药，2016，27(8)：1827-1829.

[8] 王琳琳，白莉.车前草总黄酮对大鼠前列腺增生的治疗作用及机制[J].中国老年学杂志，2016，36(14)：3359-3362.