依维莫司和MK-2206联合用药协同抑制肝癌细胞增殖

乔振宇＊，王 健＊，吕晓业，黄 芳，王 芃，李山虎，韩 民

（1.贵州医科大学附属医院肝胆外科，贵州贵阳 550001；2.军事医学科学院生物工程研究所医学分子生物学实验室，北京 100850；3.解放军总医院普外科，北京 100853）

2016年的统计资料显示，我国肝细胞癌（肝癌）的发病率约为25.7/10万，成为死亡率仅次于胃癌和肺癌的第三大恶性肿瘤［1］。目前，手术切除和肝移植仍然是早期肝癌患者最有效的治疗手段，但由于约85%患者在诊断时已处于肝癌晚期而失去了手术机会，因此系统性治疗在中晚期肝癌患者的治疗中扮演着重要角色。但传统化疗方法对于晚期肝癌患者疗效不佳，并未表现出生存益处［2］。近年来，肿瘤靶向性药物治疗为肝癌患者提供了新的治疗方法，索拉非尼（sorafenib）是目前第一个被证实能改善晚期肝癌患者总生存期的分子靶向药物，但在临床研究中也发现肿瘤对于索拉非尼治疗的反应率依然很低，而长期用药会导致肿瘤细胞转移性增加，因而迫切需要开发新的靶向性治疗药物和治疗策略［3-4］。

哺乳动物西罗莫司（雷帕霉素）靶蛋白〔mam⁃malian target of sirolimus（Rapamycin），mTOR〕是一种保守的丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶，隶属磷脂酰肌醇3-激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）类家族成员。mTOR分子能感受营养信号、控制细胞内mRNA翻译及蛋白转运和降解，并在细胞生长、增殖、存活、血管发生和自噬过程中起到重要的调控作用［5-6］。研究发现，40%～50%肝癌患者中mTOR信号通路异常激活，且与肿瘤低分化、预后不良和复发密切相关［7］。一系列临床证据以及临床前研究均表明，mTOR激酶抑制剂如西罗莫司及其衍生物依维莫司（everolimus）等可用于治疗实体瘤如食管鳞状细胞癌、肺癌、肾细胞癌和前列腺癌等，提示mTOR分子也有可能成为治疗肝癌有效的靶标。目前有研究表明，mTOR激酶抑制剂可抑制肝肿瘤细胞的生长和转移，但是临床试验发现，西罗莫司和依维莫司作为单药疗效非常有限［8-9］，这可能是因为肿瘤细胞中其他信号通路的激活导致产生耐药性，因而需要在研究耐药性的基础上提出联合用药的策略。

目前，已有相关研究发现，西罗莫司作用前列腺癌、乳腺癌等细胞后会导致PI3K/蛋白激酶B信号通路（PI3K/protein kinase B，PI3K/AKT）的反馈激活［10］而产生耐药性。本研究旨在探究西罗莫司及其衍生物依维莫司在肝癌细胞中的作用机制，继而寻找在耐药现象中发挥关键作用的相关分子，并提出有效的联合用药的策略，为肝癌的临床治疗提供有益的线索。

1 材料与方法

1.1 细胞、药物、试剂和仪器

肝癌细胞HepG2和BEL-7402为本实验室保存；西罗莫司、依维莫司、MK2206、和胰岛素样生长因子1受体（insulin-like growth factor 1 receptor，IGF-1R）抑制剂NVP-AEW541均购自美国Selleck公司；微管蛋白，磷酸化AKT（p-AKT）（Ser473），AKT和p-p70S6K（Thr389）兔多克隆抗体均购自美国Cell Signaling公司；DMEM细胞培养基购自美国Gibco公司；胎牛血清购自杭州四季青公司；三羟氨甲烷（Tris）、胰酶和四甲乙二胺（TEMED）均购自美国Sigma公司；依地酸二钠（乙二胺四乙酸二钠，ethyl⁃ene diamine tetraacetic acid，EDTA），十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）和过硫酸铵（ammonium persulfate，AP）均购自上海生工公司；山羊抗兔IgG二抗购自中杉金桥公司；CCK8试剂盒购自东仁化学科技有限公司。细胞培养箱Steri-Cycle CO2Incubator购自美国Thermo公司；冷冻离心机购自德国Eppendorf公司；蛋白电泳及湿转仪购自美国BioRad公司；EL311SX酶标仪购自美国BioTEK公司；手持式细胞计数器购自美国Milli⁃pore公司；SW-CJ-1F超净工作台购自苏州净化设备有限公司；DK-8D型电热恒温水槽购自上海一恒科技有限公司。

1.2 细胞培养

HepG2和BEL-7402细胞用含有10%胎牛血清、50 U·mL-1青霉素和100 U·mL-1链霉素的DMEM培养基，在5%的CO2培养箱中培养。

1.3 Western蛋白质印法迹检测AKT，p-AKT和p-p70S6K的表达

将肝癌细胞HepG2和BEL-7402分别接种在60 mm培养皿中培养至密度为90%作用，用西罗莫司0.1 μmol·L-1和依维莫司0.02 μmol·L-1分别处理细胞0，1，3，6，12和24 h后，收取蛋白样品；或用依维莫司 0.02 μmol·L-1和 NVP-AEW541 1.0 μmol·L-1或 MK-22061.0 μmol·L-1单独或联合处理细胞24 h后收取蛋白样品；用BCA比色法检测蛋白浓度。将蛋白样品中加入5×SDS加样缓存液，煮沸10 min，进行SDS-PAGE并湿转至PVDF膜上，用5%脱脂奶粉在摇床上封闭30 min，加入（1∶1000）稀释的一抗后在4℃摇床过夜。用TBST洗膜液洗3次，每次5 min，加入（1∶5000）稀释的二抗室温6 h，之后用TBST洗膜3次，每次5 min，在暗室用化学发光液显影、定影。Quantity One软件对蛋白印迹进行积分吸光度（integrated absorbance，IA）分析，蛋白表达水平用IA目标蛋白／IA微管蛋白比值表示。

1.4 CCK8法检测细胞存活

取生长状态良好的HepG2或BEL-7402细胞消化计数后，以每孔3000个细胞的密度将细胞接种于96孔板，每行3孔，每孔150 μL培养液。第2天待细胞贴壁后，以每孔50 μL的总量将RAD001和MK2206分别或联合加入每孔中，终浓度分别为依维莫司 0.02 μmol·L-1和 MK2206 1.0 μmol·L-1，细胞对照组中加入50 μL DMSO。细胞培养72 h后，用真空泵吸干每孔的培养液并在在超净台中晾干。以10∶1的比例用DMEM稀释CCK8试剂，之后每孔加入95 μL稀释好的CCK8试剂，继续将细胞培养板放在CO2培养箱中1.5 h后取出，用酶联免疫检测仪在450 nm波长下测定各孔样品吸光度值（A450nm）值，实验重复3次。细胞相对存活率（%）=实验组A450nm/细胞对照组A450nm×100%

1.5 细胞平板克隆形成实验检测细胞增殖

取对数生长期的HepG2和BEL-7402细胞消化计数后，将细胞悬液按梯度倍数稀释后接种于6孔板中，接种密度为每孔4000细胞。待细胞贴壁后，用MK2206 1.0 μmol·L-1和依维莫司 0.02 μmol·L-1单独或联合处理细胞。待在细胞培养箱箱中培养7 d后取出培养皿，移除培养液并用1 mL PBS小心清洗2次，加4%多聚甲醛固定15 min。去固定液后加甲紫（结晶紫）染色30 min。用流水缓慢洗去染色液，放在空气中干燥。显微镜下计数≥10个细胞的克隆数，实验重复3次取均值。

1.6 统计学分析

实验结果数据用x±s表示，利用SPSS 20.0统计分析软件进行统计分析，两组间比较采用单因素方差分析和t检验，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 西罗莫司和依维莫司对BEL-7402和HepG2细胞中p-70S6K和AKT激酶表达水平的影响

Western蛋白质印迹检测结果显示（图1），用依维莫司0.02 μmol·L-1和西罗莫司0.1 μmol·L-1分别处理肝癌细胞BEL-7402和HepG2后，随着作用时间的延长，mTOR激酶下游p-p70S6K蛋白表达水平显著降低（P＜0.05），同时p-AKT表达水平显著提高（P＜0.05），AKT总蛋白表达水平无显著改变（数据略）。表明在肝癌细胞中mTOR抑制剂可能通过抑制p70S6K激酶的活性引起AKT激酶的反馈激活。

Fig.1 Effect of everolimus（A1，A2，C1 and C2）and sirolimus（B1，B2，D1 and D2）on protein expression of total protein kinase B（t-AKT），phosphorated AKT（p-AKT），and p-p70S6K in BEL-7402（A and B）or HepG2（C and D）cells by Western blotting.The cells were treated with everolimus 0.02 μmol·L-1or sirolimus 0.1 μmol·L-1for 0，1，3，6，12 and 24 h，respectively.IA：integrated absorbance.A2，B2，C2 and D2 were the semi-quantitative results of A1，B1，C1 and D1，respectively.x±s，n=3.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with cell control（0）group.

2.2 依维莫司联合NVP-AWE541对HepG2和BEL-7402细胞p-AKT和p-p70S6K激酶表达水平的影响

Western蛋白质印迹检测结果（图2）显示，与细胞对照组相比，依维莫司0.02 μmol·L-1单独处理HepG2和BEL-7402细胞后，p-p70S6K蛋白表达水平显著降低的同时p-AKT的表达水平显著提高（P＜0.01）；NVP-AEW541 1.0 μmol·L-1单独处理组，HepG2细胞p-AKT、BEL-7402细胞p-AKT和p-p70s6k表达水平显著降低（P＜0.01）。当NVPAEW541 1.0 μmol·L-1和依维莫司0.02 μmol·L-1联合处理2种肝癌细胞后，p-p70S6K蛋白表达水平显著降低的同时p-AKT表达水平也被显著抑制（P＜0.01），AKT总蛋白表达水平无显著改变（数据略）。说明抑制IGF-1/IGF-1R信号通路则抑制了依维莫司对AKT激酶的反馈激活。

Fig.2 Effect of everolimus（Evero）and NVP-AEW541（AEW541）combination on protein expression of t-AKT，p-AKT and p-p70S6K in HepG2（A）or BEL-7402（B）cells by Western blotting.The cells were treated with everoli⁃mus 0.02 μmol·L-1and NVP-AEW541 1.0 μmol·L-1alone or in combination for 24 h.A2 and B2 were the semi-quantitative re⁃sults of A1 and B1，respectively.x±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with cell control group；##P＜0.01，compared with everolimus group.

2.3 依维莫司联合MK2206对BEL-7402和HepG2细胞AKT激酶水平表达的影响

Western蛋白质印迹结果（图3）显示，与细胞对照组相比，MK2206 1.0 μmol·L-1单用可显著抑制p-AKT表达水平（P＜0.05），而和依维莫司0.02 μmol·L-1联合使用后，与依维莫司单独处理相比显著抑制了p-AKT的表达水平（P＜0.01），AKT总蛋白表达水平无显著改变（数据略）。表明MK2206可有效抑制依维莫司对肝癌细胞AKT激酶活性的反馈激活功能。

Fig.3 Effect of everolimus（Evero）and MK2206（MK）combination on protein expression of t-AKT and p-AKT in BEL-7402（A）or HepG2（B）cells by Western blot⁃ting.The cells were treated with everolimus 0.02 μmol·L-1and MK2206 1.0 μmol·L-1alone or in combination for 24 h.A2 and B2 were the semi-quantitative results of A1 and B1，respectively.x ± s，n=3. ＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with cell control group；##P＜0.01，compared with everolimus group.

2.4 依维莫司联合MK2206对HepG2和BEL-7402克隆形成和细胞存活的影响

克隆形成实验（图4 A1，B1，B2）结果显示，与单用依维莫司或MK2206相比，依维莫司0.02 μmol·L-1联合MK2206 1.0 μmol·L-1处理肝癌细胞7 d，克隆形成数显著降低（P＜0.05）。另外CCK-8检测结果显示（图4C1和C2），与细胞对照组相比，依维莫司0.02 μmol·L-1和MK2206 1.0 μmol·L-1单用均能抑制肝癌细胞存活，而依维莫司和MK2206联合处理后，显著增强了单独用药下对肝癌细胞生长的抑制作用（P＜0.01）。

Fig.4 Effect of everolimus（Evero）and MK2206（MK）in combination on proliferation of HepG2（A1，B1 and C1）or BEL-7402（A2，B2 and C2）cells detected by plate clone formation assay（A1，A2，B1 and B2）and CCK8（C1 and C2）assay.The cells were treated with everolimus 0.02 μmol·L-1and MK2206 1.0 μmol·L-1alone or in combination for 7 d for plate clone formation assay（A）or 72 h for CCK-8 assay（B），respectively.x±s，n=3. ＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with cell control group；#P＜0.05，#P＜0.01，compared with MK alone group；ΔΔP＜0.01，compared with Evero alone gruop.

3 讨论

本研究发现，mTOR激酶抑制剂依维莫司和AKT激酶抑制剂MK2206联合作用肝癌细胞，可显著增强单独用药下对肝癌细胞生长的抑制作用。

目前只有索拉非尼被证实是能改善晚期肝癌患者总生存期的分子靶向性药物，因而深入研究新的靶向性药物以及提出新的治疗策略具有非常重要的意义［11］。mTOR信号通路异常与肿瘤的发生密切相关，因而成为一种有效的肿瘤治疗靶点。mTOR激酶抑制剂西罗莫司是一种天然的大环内酯类化合物，在细胞内可与他克莫司（tacrolimus，FK506）结合蛋白12（FKBP12）特异性地结合，形成复合物并作用于mTOR的FRB域从而抑制其活性［12］。西罗莫司的衍生物坦西莫司（temsirolimus）和依维莫司已被FDA和EMA批准用于肾细胞癌、外套细胞淋巴瘤、室管膜下巨细胞细胞瘤和胰腺神经内分泌肿瘤的治疗［13］。然而，越来越多的临床报告显示，西罗莫司及其衍生物在临床治疗当中的效果并不理想，患者会对西罗莫司治疗产生耐药性［14］。

导致西罗莫司及其衍生物产生耐药性的分子机制之一是其对PI3K/AKT信号通路的反馈激活［16-17］。PI3K/AKT信号通路是mTOR的上游调控分子，参与细胞代谢、增殖、存活和侵袭等调控功能［15］。活化的AKT分子磷酸化并激活下游分子mTOR和核糖体蛋白S6激酶β-1（ribosomal protein S6 kinase beta-1，S6K-β1），反之被激活的S6K-1可抑制PI3K上游调控分子胰岛素受体底物1（insu⁃lin receptor substrate 1，IRS-1）的功能活性，导致PI3K/Akt通路无法被正常激活，从而形成了一种负反馈抑制环路［16-17］。西罗莫司及其衍生物抑制mTOR活性后导致S6K-β1无法行使其抑制IRS-1的功能，原本存在的反馈抑制环路被打破，PI3K/AKT信号通路被激活，继而肿瘤产生耐药。

本研究发现，在西罗莫司和衍生物依维莫司作用下肝癌细胞中的AKT激酶活性明显被激活，而利用IGF-1R的抑制剂NVP-AEW541有效抑制了依维莫司作用下对AKT激酶的反馈激活，从而提示S6K-β1通过IGF-1/IGF-1R/IRS-1信号通路反馈抑制PI3K/AKT激酶活性。抑制PI3K/AKT通路的反馈激活是目前克服西罗莫司耐药性的主要研究方向，通过将细胞经西罗莫司处理后异常激活的信号通路组分如IGF-1R或AKT的活性加以抑制，即用联合用药的方法可达到更好的抑癌效果［18-19］。Sun等［14］采用PI3K抑制剂LY294002和西罗莫司联合用药处理非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）细胞，发现对NSCLC的生长和克隆形成能力都有很好的抑制效果；Wan研究组［20］联合使用mTOR和IGF-1R抑制剂，发现增强了单用西罗莫司的临床治疗效果，而本研究中我们使用依维莫司和MK2206联合抑制了mTOR激酶和AKT激酶活性，则显著抑制了肝癌细胞的生长和增殖能力。因而，通过本研究我们初步探索了肝癌细胞对西罗莫司及其衍生物耐药的分子机制以及联合用药的策略，从而为肝癌患者分子靶向性治疗药物提供了一定的参考。

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