不同分子量丝素肽的开发

钱 坤，刘 迪，徐国文

（1.湖州师范学院，浙江 湖州 313000； 2.浙江大学 动物科学学院，浙江 杭州 310058；3.湖州新天丝生物技术有限公司，浙江 湖州 313000）

蚕丝是人类最早利用的天然蛋白质纺织纤维材料之一，享有“纤维皇后”之美誉。具有良好的吸湿性和优雅的光泽，丝绸服装穿着舒适、优美、典雅，对人体有良好的保健功能，深受国内外消费者喜爱。随着对蚕丝结构研究的不断深入，其开发利用的研究领域也不断的拓宽，逐渐延伸到食品、发酵、生物制药、工业新材料、医用材料及化妆品等领域，并呈现出蓬勃发展的态势。蚕丝蛋白在食品、新型保健品的应用更是雨后春笋般的发展。丝素肽作为小分子肽更容易被人体吸收，更适合在保健食品上的开发与应用［1～3］。丝素是一种天然的大分子纤维蛋白质，分子量在30万±0.5万道尔顿。用生物化学工程法精加工成分子量500～5000（d）的可溶性丝素肽，可作为食品工业、医药工业、化妆品工业的特殊营养添加剂［4］。制取丝素肽的原料可用缫丝、织绸中的下脚料，经脱胶净化等加工成纯丝素。蚕丝纤维的主要成分是丝胶和丝素，另外还有少量的蜡质层，碳水化合物，色素，无机成分，一般蚕丝含丝素70%～80%，丝胶25%左右，其它物质2.5%左右。（茧衣中丝胶含量有40%～42%丝素含量相对较低），丝素蛋白属于硬蛋白，与皮肤表层，毛发角蛋白属同一大类，丝素蛋白的分子量最大达30万±0.5万道尔顿。丝素为纤维状结构，每根茧丝由两种平行单丝黏合而成，每根单丝中间为丝素纤维，外为丝胶，丝素纤维的断面积平均为80μ2，每根丝素纤维由50～100根细纤维经丝胶黏合而成。细纤维又由径为10μ的微纤维组成，而微纤维由蛋白质分子构成［5］。

丝素蛋白中的各种氨基酸由肽键（-CONH-）联结成肽链，再通过肽键、氢键、酯键、盐键、二硫键等构成蛋白质。丝素纤维的蛋白质结构分为结晶区、非结晶区，每个结晶区和非结晶区都会有若干条肽链的链段，而每条肽链都要通过若干个结晶区和非结晶区，结晶区主要由甘氨酸、丙氨酸和丝氨酸组成，比例大致为3∶2∶1，甘氨酸和丙氨酸总量占70以上，而非结晶区主要由酸性氨基酸、碱性氨基酸、脯氨酸、酪氨酸等组成［6］。根据丝素纤维蛋白的结构特点，可以采用不同的方法，使高分子量的丝素，转变成分子量较低可溶于水的多肽。在酸碱溶液、氯化钙中性溶液中，由于H+、OH-、Ca2+、Cl-等极性离子的作用，水分子不仅进入丝素的非结晶区，而且进入结晶区，削弱了分子链间的范德华力，使丝素分子从紧密状态变成疏松无序状态，无限膨润分解。分子量下降到10×102～10×102的多缩氨酸。丝素肽的分子构象为无规卷曲结构为主，这使具有优良的水溶性，可以在不添加任何乳化剂、分散剂情况下，按任意比例与其它水溶性原料掺和，同时又保持了平衡状况下各类氨基酸。

现介绍将分子量在30万±0.5万、结构比较复杂，一般情况下人体难于消化吸收的丝素转变成由平均分子量为90的氨基酸及由5个至6个直至100个左右构成的多肽类物质，以及单一氨基酸的复合物，可以采用强酸、强碱、中性盐和酶等降解剂予以消化。

1 中性盐法制备丝素肽

按照氯化钙∶水∶丝素＝1∶2∶5，即100 g丝素（干）200 g CaCl2（试剂级），500 m l水（纯水）配方，先将CaCl2溶于水成溶液，加温至沸110℃±2℃时，投丝素（105℃可投），100 min内，在搅动情况下就会全部溶解，加入少量（1左右）纯水，冷却后，装入透析袋透析。由于半透膜的盐渗析作用，72 h内，可将绝大部分Ca2+、Cl-带走，而剩下丝肽蛋白此时的平均分子量一般为10000 D左右，此方法所得产品平均分子量较大，水溶性很好，色泽为纯白色，可在塑袋真空装下。

上述获得的丝肽，再经碱或酶降解，就可得平均分子量较低的丝肽，如表1、表2所示。

表1 不同浓度氢氧化钠（0.05 N～0.1N）的碱解结果

表2 不同浓度氢氧化钠（0.05N）的碱解结果

经透析水解液用胰酶进一步降解，那么丝肽的质量更好。因为采用NaOH，必须用中和法除去，加了丝肽中盐分的含量，往往使灰分达不到规定指标。

胰酶的降解需掌握以下条件，当丝素的中性盐水解液，经半透膜渗析除盐72 h～90 h后，一般Ca2+Mg2+的含量在＜80 mgN/升氯根＜80 mgN/升，（2 mg～3 mg当量）。灰分能达规定指标要求。此时将透析液煮沸后，测总固含量，再按总固量加0.1%～0.5%的胰酶（先用氨水调水解液pH 7.5～8）。40℃±2℃下恒温2 h～4 h不等。再升温失活，加活性炭脱色（活性炭量视液体色泽而定，色浅也可不加活性炭）然后浓缩，喷粉，可得成品。

蚕丝蛋白在分解反应过程中，由于酶的作用，微量氨基酸分子结构发生断裂，即蚕丝蛋白中的微量丙氨酸（ɑNH丙酸）、丝氨酸（ɑOH丙酸）、胱氨酸（ɑNHßSH丙酸）的COOH等基团产生了裂解转位，从而会形成微量丙酸基团。当然，酶解浓度、时间的变化都会对裂解的效果产生影响。所产生的丙酸含量大约在10 mg/kg～100 mg/kg左右。

2 中性盐-乙醇法制备丝素肽

有文献［7～9］介绍采用CaCl2-C2H5OH溶液溶解丝素的方法，其比例为氯化钙∶乙醇∶水＝1∶2∶8（M比，即摩尔比），而丝素与以上三元溶液的浴比为1∶50和1∶25。我们根据自己的经验，列出如下表（表3），再行选择。

表3 采用三元溶液配方表（丝素浴比为1：8）

1 mol CaCl2为 146 g，1mol H2O 为 18 g，1 mol C2H5OH为46 g。取3号配方及1∶8浴比进行实验室试验：取净化毛丝丝素160g。氯化钙=水∶乙醇=146∶144∶92=38.2%：37.7%∶24.1%。故此，需CaCl22H2O 160×8×38.2%=489 g，需H2O483g和乙醇308 g。由于乙醇为95%浓度，已含水23 g，所以实际需水460 g和乙醇331 g（95%含量）。以上配成三元溶液计1280 g，水浴加热至70℃投入丝素，在70℃±2℃的条件下进行水解，1.5 h左右溶解，再经2h水解。水解时要装乙醇回流装置，防止乙醇浓度降低。然后扎带用透析包透析，除盐后过滤测总固，经中科院上海昆虫所采用凝胶电泳法检测，其分子量峰值集中在48000 D～67000 D，以后再采用此法连续投料，得透析液，采用喷雾干燥，得白色丝肽粉。所以，采用以上工艺可以生产50000 D～70000 D高分子丝肽。

3 酸、碱水解法制备丝素肽

我们重点选用硫酸和氢氧化钡、氢氧化钙，因为硫酸钡的溶解度极低，并且可以用离子交换732树脂除去部分钙、镁离子，使成品的灰分降到标准以下。BaSO4在纯水中，25℃时溶解度为1.04×10-5M（摩尔/升），或为2.8 mg/L，CaSO4在25 ℃时在纯水中溶解度为7.8×10-3摩尔/L（1摩尔BaSO4171 g，1摩尔CaSO4136 g，171×1.04×10-5=0.0017784 g/L，136×7.810-3=1.0608 g/L）。如果在常温下用硫酸或用氢氧化钡相互中和后，在溶液中所含BaSO4的量为0.0018 mg/L，而含量为10%丝肽液1000 L，可喷100 kg粉，内可能含BaSO4为0.0018×1000=1.8 g，只占1.8 g/100 kg，即十万分之一点八克。而同样用Ca（OH）2中和H2SO4，在常温下溶液所含硫酸钙的浓度为1.0608×1000=1061 g，即1.061 kg/100 kg。

这只是理论计算，在实际操作中，由于中和过滤温度较高含量还会增加。

用盐酸酸水解制备丝素肽的方法，例如，采用3 N～4 N盐酸，按1∶3浴比对丝素进行16 h～18 h水解，然后用减压去酸办法，除去部分盐酸，再用碱中和至pH 5～7。但内含氯化钠量较多，虽用活性炭脱色，可得淡黄丝肽液，但含量较低，质量较差，无法制成固体粉末。改用硫酸代替盐酸用15%～22%硫酸，不完全水解丝素。经过15 h～18 h，再用氢氧化钡或氢氧化钙中和除去硫酸，可得丝素肽液体，经脱色过滤离子交换发脱灰生产液态丝素肽，或喷粉成固体。如将以上水解液测总固后，再用胰酶水解成分子量较低的丝素肽。

22%H2SO4回流水解22 h，然后用Ba（OH）28H2O中和至终点（pH 5.33～5.5）搅0.5 h，板框压滤，滤液得淡黄色滤液，测含固（投111 kg净干，得860 L脱色液，含固0.06033 g/ml，共得51.63 kg，Mn132）。采用732～717树脂纯化，去除重金属，各0.5 h，即可得低分子量的丝肽。

总之，利用蚕丝丝素，经生物化学法，精加工生产分子量为500 D～10000 D的系列丝素肽，作为食品、化妆品、医药材料的重要原料，从而可将废蚕茧丝低值原料加工为高附加值产品。